葉翠萍 王文倩 趙明明 曾 勇 古 銳成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

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藏藥渣馴及其不同萃取部位抗胃潰瘍抗肝損傷作用的比較研究

葉翠萍 王文倩 趙明明 曾 勇*古 銳
成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

目的:研究藏藥渣馴及其不同萃取部位的抗胃潰瘍、抗肝損傷作用，初步探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:采用消炎痛致小鼠胃潰瘍模型考察渣馴及其不同萃取部位的抗胃潰瘍作用；采用刀豆蛋白A(ConA)致小鼠肝損傷模型考察渣馴及其不同萃取部位抗肝損傷作用。結(jié)果: 渣馴及其水萃取部位、正丁醇部位能明顯降低消炎痛所致胃潰瘍小鼠的潰瘍指數(shù)(P<0.05)，能夠明顯降低ConA所致的肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)(P<0.05)，顯著降低血清中ALT、AST含量(P<0.01)。結(jié)論: 藏藥渣馴及其水萃取部位、正丁醇部位可能為渣馴治療胃潰瘍和肝損傷的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

渣馴; 萃取部位; 消炎痛; 胃潰瘍; 刀豆蛋白A; 肝損傷

藏藥渣馴，因產(chǎn)地和各地語言不同，名稱各異，目前在國際上尚無統(tǒng)一的名稱。英文文獻(xiàn)中多以mumie，shilajit等名出現(xiàn)，在哈薩克族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中名為“塔斯馬依”[1]，國內(nèi)主要分布在新疆阿爾泰山、天山及西藏地區(qū)。藥理研究表明，渣馴具有抗炎、抗?jié)?、抗氧化?yīng)激、抗菌、抗焦慮、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織再生等藥理作用[1]，此藥應(yīng)用廣泛，療效確切。GOEL RK[2]及Ghosal S[3]報道，渣馴能夠增加碳水化合物與蛋白質(zhì)之比而降低胃潰瘍指數(shù)，通過增加黏液屏障發(fā)揮抗胃潰瘍作用。VaishwanarI等[4]發(fā)現(xiàn)渣馴能夠促進(jìn)四氯化碳所致肝損傷動物肝組織的再生。但國內(nèi)對該藥的研究及報道甚少，課題組前期研究結(jié)果表明藏藥渣馴對小鼠無水乙醇型胃潰瘍有較好的治療作用[5]。藏藥渣馴具有明確的抗胃潰瘍、抗肝損傷作用，但發(fā)揮該藥理作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，本研究擬對這一問題進(jìn)行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器 T500型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；FA1104分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；滬制02050123游標(biāo)卡尺(無錫錫工量具有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數(shù)儀(美國Thermo公司)。

1.2 材料 渣馴藥材購自四川省阿壩州馬爾康縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)降擁四郎主任藏醫(yī)師鑒定為正品。鹽酸雷尼替丁膠囊(批號：141003，北大醫(yī)藥股份有限公司)；吲哚美辛腸溶片(批號：141102，山西太原藥業(yè)有限公司)；刀豆蛋白A(Con A，批號：SLBJ7401V，美國sigma公司)；聯(lián)苯雙酯滴丸(批號：A02150303，萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號：20160419)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號：20160422)購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物 昆明種小鼠，SPF級，體重18～22g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2008-24。6～8周齡雄性Balb/C小鼠，SPF級，體重18～22g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030。

2 方法

2.1 渣馴及其不同萃取部位的制備 按照《藏藥炮制規(guī)范2008年版》制備渣馴膏[6]，取適量正品渣馴樣品用100℃開水浸泡并過濾3次，收集濾液后用16層紗布濾過。將得到的濾液濃縮至濃稠狀態(tài)，后將濃稠液在水浴鍋中揮至流膏狀為渣馴膏。取適量渣馴膏水溶解液用正丁醇在5000mL分液漏斗中進(jìn)行萃取分離。多次萃取直到萃取層呈無色狀，得渣馴正丁醇部位及水萃取部位。

2.2 渣馴及其不同萃取部位對消炎痛致小鼠胃潰瘍的保護(hù)作用 昆明種小鼠56只，雌雄各半，預(yù)先置于動物房中飼養(yǎng)3d適應(yīng)環(huán)境，按體重分層隨機(jī)分為7組，即正常對照組，模型組、陽性組、正品渣馴組、渣馴水萃取部位組、渣馴正丁醇部位組、渣馴代用品組，每組8只。各組動物以20mL/kg(以體重計)連續(xù)灌胃給藥7d，1次/d，空白對照組及模型組給予同體積的蒸餾水，陽性組給予40mg/kg雷尼替丁[7]，其余各給藥組給藥劑量折合成渣馴生藥量為333mg/kg，相當(dāng)于臨床給藥量的10倍。于末次給藥1h后，腹腔注射消炎痛40mg/kg[8]，給藥體積為10mL/kg進(jìn)行造模，造模前，禁食不禁水24h。造模后6h，打開腹腔，結(jié)扎幽門和賁門，摘取全胃，胃內(nèi)注射10%甲醛固定液1mL，并置于10%的甲醛固定液中，固定10min后，沿胃大彎剪開全胃，計算潰瘍指數(shù)及抑制率。

2.3 渣馴及其不同萃取部位對Con-A致小鼠肝損傷的保護(hù)作用 將56只Balb/C小鼠隨機(jī)分成7組，分組及給藥(除陽性組灌胃給予200mg/kg聯(lián)苯雙酯[9-11])同2.2。末次給藥后1h，除空白對照組，其余各組尾靜脈注射Con A 20mg/kg[9-11]，給藥體積為10mL/kg進(jìn)行造模，

禁食不禁水8h后，稱量小鼠體重；眼球取血，分離血清，酶標(biāo)儀法測定血清中ALT、AST含量。取血后所有動物脫臼處死，摘取肝臟并用冰生理鹽水漂洗除去積血，表面拭干后稱重，計算肝臟指數(shù)。

2.4 指標(biāo)檢測及計算方法

2.4.1 潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率計算方法 將固定后的胃放于10倍放大鏡下計數(shù)潰瘍點(diǎn)數(shù)，并計算潰瘍指數(shù)[5]：潰瘍點(diǎn)或面1mm以下者，計1分；1～2mm者，計2分；2～3mm者計3分；3～4mm者，計4分；大于4mm者，計5分；若病灶內(nèi)徑>2mm者計分加倍，將計分相加即為該動物的潰瘍指數(shù)。并計算潰瘍抑制率：潰瘍抑制率(%)=(模型對照組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/模型對照組潰瘍指數(shù)×100%。

2.4.2 血清中ALT、AST檢測方法 準(zhǔn)確稱取小鼠肝臟組織0.1g，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.9mL的生理鹽水，冰水浴下勻漿，2500r/min，離心10min，取上清液待測；96孔板預(yù)設(shè)的對照孔中加入已預(yù)溫的(ALT/AST)基質(zhì)液0.02mL，測定孔中加入基質(zhì)液0.02mL和0.005mL待測樣本，反復(fù)吸打混勻后，37℃水浴30min后，分別加入2,4-二硝基苯肼液0.02mL，對照孔中加入待測樣本0.005mL，37℃水浴20min后分別加入0.4mol/L氫氧化鈉液0.2mL，輕輕水平搖動96孔板混勻，室溫放置15min，波長510nm，酶標(biāo)儀測定各孔OD值，計算絕對OD值(絕對OD值=測定孔OD值-對照孔OD值)，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的ALT/AST含量。

2.4.3 肝臟指數(shù)計算方法 肝臟指數(shù)(%)=肝臟全重(g)/動物體重(g)×100%。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析方法和非參數(shù)兩個獨(dú)立樣本t檢驗方法進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 渣馴及其不同萃取部位對消炎痛致小鼠胃潰瘍的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠潰瘍指數(shù)顯著升高(P<0.01)，說明小鼠胃潰瘍模型制備成功。與模型組比較，正品渣馴、渣馴水萃取部位及渣馴正丁醇部位能明顯降低小鼠胃潰瘍指數(shù)(P<0.05)，且組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 渣馴及其不同萃取部位對小鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率的影響 (x±s，n=8)

注:與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

3.2 渣馴及其不同萃取部位對Con-A致小鼠肝損傷的影響

3.2.1 渣馴及其不同萃取部位對Con-A致肝損傷小鼠血清ALT、AST水平影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST活性明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，正品渣馴、渣馴水萃取部位、渣馴正丁醇部位組小鼠血清ALT，AST活性明顯降低(P<0.01)，其中渣馴正丁醇部位影響最為顯著。見表2。

表2 渣馴及其不同萃取部位對小鼠血清ALT、AST水平影響 (x±s，n=8)

注:與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.2.2 渣馴及其不同萃取部位對Con-A致肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響與正常對照組比較，模型組小鼠臟器指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，正品渣馴、渣馴水萃取部位、渣馴正丁醇部位均能明顯降低小鼠臟器指數(shù)(P<0.05)，其中渣馴正丁醇組更為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 渣馴及其不同萃取部位對小鼠臟器指數(shù)的影響 (x±s，n=8)

注:與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

4 討論

傳統(tǒng)藏藥渣馴(Brag-zhun)味甘、苦，性涼，功能清熱。主要用于肝、腎、胃、小腸等熱性疾病，木布病，虛弱勞損，痛風(fēng)等。藏醫(yī)典籍《月王藥診》中記載，“渣馴能干枯膿血，主治肝病，清諸熱，誘發(fā)寒癥”[12]。《論說續(xù)》中亦記載“渣馴能治療一切熱證，特別是清胃熱、清肝熱、清腎熱等，療效顯著”[13]。藏醫(yī)胃潰瘍和肝損傷均屬于藏醫(yī)學(xué)中培根木布病的范疇[14-15]，而“木布病”是隆、赤巴、培根以及血液、黃水疾病混合在一起的綜合性疾病，其發(fā)病的病因及病程復(fù)雜，治療難度大，是藏區(qū)的一種常見病、多發(fā)病、慢性病。渣馴對胃潰瘍[16]和肝損傷具有明確的治療作用。本研究中，采用消炎痛致小鼠胃潰瘍模型和刀豆蛋白A(ConA)致小鼠免疫性肝損傷模型考察渣馴及其不同萃取部位的抗胃潰瘍、抗肝損傷作用，結(jié)果表明：渣馴及其水萃取部位、正丁醇部位能明顯降低胃潰瘍小鼠的潰瘍指數(shù)(P<0.05)，能夠顯著降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量(P<0.01)，明顯降低肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)(P<0.05)，提示藏藥渣馴及其水萃取部位、正丁醇部位可能為渣馴治療胃潰瘍和肝損傷的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，其作用機(jī)制及具體的有效成分有待進(jìn)一步研究，以期開發(fā)出更有效的抗胃潰瘍、抗肝損傷的藥物制劑。

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Comparative Study ofAntiulcerogenic and Anti-liver Injury Effects of Different Fraction from Tibetan Medicine Brag-zhun

YE Cuiping WANG Wenqian ZHAO Mingming ZENG Yong*GU Rui

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China

Objective To investigate the protective effectof different fraction from Tibetan medicine Brag-zhun on ulcerogenic andliver injury,primary discussion for the efficacy material base.Methods The gastric ulcer model induced by indomethacin was adopted in the research of antiulcerogenic effect,and the liver injury modelinduced by Concanavalin A was observed in the study of anti-liver injuryeffect. Results Brag-zhun and its water extraction parts, n-butyl alcohol parts can obviously reduce the ulcer index of indomethacin-induced gastric ulcer in mice (P<0.05), can significantly reduce liver index of Con A-induced liver injury in mice(P<0.05), significantly lower serum ALT, AST levels (P<0.01).Conclusion Tibetan brag-zhunand its water extraction parts, n-butyl alcohol parts maybe the efficacy material base for the treatment of the gastric ulcer and the liver injury , its mechanism needs further research.

Brag-zhun; Fraction;Indomethacin;Ulcerogenic;Concanavalin A; Liver Injury

江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目(JXXT201402008-1)；國家自然科學(xué)基金面上項目(313911)。

葉翠萍(1985-),女,漢族,碩士研究生在讀,研究方向為中藥藥效與毒理。E-mail:460323715@qq.com

曾勇(1976-)，男，漢族,教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥效與毒理。E-mail：zengy1976@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)07-0039-03

2017-02-13 編輯：程鵬飛)