伍明江，敖 靜，周 敏，蔣朝暉，吳曉黎

刺薏復(fù)方不同制備物對輻射后小鼠外周血白細(xì)胞的影響＊

伍明江，敖 靜，周 敏，蔣朝暉，吳曉黎

目的 比較刺薏復(fù)方不同提取方法制備的藥物對輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞的影響。方法 分別用水和75%乙醇溶液對刺薏復(fù)方中藥物進(jìn)行提取，以干浸膏得率和刺五加中紫丁香苷作為提取考察指標(biāo)，并將不同制備所得的干浸膏按處方比灌胃BALB/c小鼠14 d后，以4GY Co60γ射線一次性全身照射，比較小鼠照射前、照射后第3天、照射后第14天外周血白細(xì)胞的變化。結(jié)果 刺薏復(fù)方水提取干浸膏得率和紫丁香苷含量均較75%乙醇提取要高，烏梅單獨(dú)水提取按處方比加入復(fù)方水提取灌胃小鼠，能顯著增加輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的作用。結(jié)論 刺薏復(fù)方以烏梅單獨(dú)水提取并加入復(fù)方水提取的方法能顯著增加輻射后外周血白細(xì)胞總數(shù)。

刺薏復(fù)方；提取；抗輻射；外周血白細(xì)胞

輻射是一種新型污染，人體長期受到輻射，會(huì)使造血系統(tǒng)細(xì)胞受損，導(dǎo)致外周血白細(xì)胞減少，機(jī)體免疫功能下降，甚至機(jī)體的蛋白質(zhì)、核酸、酶、染色體發(fā)生畸變［1，2］，造成對多個(gè)系統(tǒng)的危害［3］，特別是對男性生殖系統(tǒng)有較大影響［4］。人體遭受輻射后出現(xiàn)疲乏無力、頭昏眩暈、五心煩熱等癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為是熱盛傷陰、津液受損、氣血不和、脾胃失調(diào)、耗氣傷血及肝腎虧損，因而提出了運(yùn)用復(fù)方制劑進(jìn)行清熱解毒、生津潤燥、涼補(bǔ)氣血、健脾和胃、滋補(bǔ)肝腎的治療原則，以達(dá)到對機(jī)體整體調(diào)理的目的［5］。

刺薏復(fù)方由貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院資深中醫(yī)專家根據(jù)長期治療腫瘤、血液病、體虛的臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代醫(yī)藥研究進(jìn)展組成的方劑。該方由刺五加、薏苡仁、酸棗仁、烏梅等藥物組成。刺五加為君，能益氣健脾，溫陽補(bǔ)腎，培補(bǔ)先天，培其生命之本；以薏苡仁為臣，健脾利濕，培養(yǎng)后天之本，健脾胃、強(qiáng)氣血，有生化之源；酸棗仁養(yǎng)心安神，安心神定，睡眠充足，脾腎功能運(yùn)轉(zhuǎn)正常，脾腎二臟相輔相成，氣旺精足，用之為佐；烏梅用其收斂之性，止其汗，用其酸味開胃生津，用之為使。據(jù)報(bào)道，該方中刺五加、薏苡仁等藥物均有不同程度的抗輻射輔助保護(hù)作用，整方注重從提高機(jī)體免疫功能來達(dá)到抗輻射輔助保護(hù)作用［6-10］。

基于刺薏復(fù)方抗輻射的有效作用，本研究從后續(xù)擬開發(fā)的有關(guān)刺薏復(fù)方抗輻射制劑角度考慮，重點(diǎn)考察刺薏復(fù)方不同提取方法浸膏得率以及所配比藥物對輻射外周血白細(xì)胞的影響，通過不同提取方法有關(guān)指標(biāo)考察和外周血白細(xì)胞恢復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究，以期確定刺薏復(fù)方的提取方法以及增加輻射后外周血白細(xì)胞的藥物配比。本研究旨在為刺薏復(fù)方及其抗輻射有關(guān)制劑的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物為BALB/c小鼠，重量（20±2）g，雌性，一級清潔動(dòng)物，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)藥物為刺五加、薏苡仁、酸棗仁、烏梅，均購買于貴陽市中藥材市場。各藥材均經(jīng)貴州省藥檢所林開中老師鑒定；紫丁香苷對照品購買于中國藥品生物制品檢定所，批號：111574-200502；螺旋藻片購買于南寧健星生物技術(shù)有限公司，批準(zhǔn)文號：南衛(wèi)食字［2004］第20180號。主要試劑為乙醇、甲醇，均購買于天津市康科德科技有限公司，白細(xì)胞稀釋液自制（冰醋酸2.0ml、1%甲紫，蒸餾水加至100ml），5%火棉膠，消毒碘酒等。主要儀器為GWGP 80型鈷-60治療機(jī)（中國核動(dòng)力院設(shè)備制造廠），Agilent 1100高效液相色譜儀 （美國安捷倫科技有限公司），潔凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜（蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展科技發(fā)展公司），CX31光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 以傳統(tǒng)用藥方法為提取的基本依據(jù)，對刺薏復(fù)方進(jìn)行水和75%乙醇提取。但基于烏梅中含有大量有機(jī)酸，具有較強(qiáng)的酸性（經(jīng)測試：烏梅8倍量水提液pH=3，其他藥物提取液為中性），與復(fù)方中其他藥物一起提取可能會(huì)造成有效成分的酸水解，因此，考察了烏梅另行提取的方案。水提取或75%乙醇提取均檢測了刺五加中紫丁香苷的含量。

提取方法有兩種：（1）水煎煮提取。分別將刺薏復(fù)方四味藥，刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥，烏梅一味藥三組藥物進(jìn)行水煎煮2次，3 h/次。第1次加10倍量水，過濾，藥渣第2次加8倍量水，過濾，將2次濾液合并，3000 rpm離心15min，分離上清液，水浴蒸干濃縮，再減壓干燥成干浸膏，即得。（2）75%乙醇回流提取。分別將刺薏復(fù)方四味藥，刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥，烏梅一味藥三組藥物加75%乙醇回流提取2次，第1次加8倍量75%乙醇，回流提取12 h，過濾，藥渣第2次加5倍量75%乙醇，回流提取3 h，過濾，將2次濾液合并，3000 rpm離心15min，分離上清液，減壓濃縮，再干燥成干浸膏，即得。

干浸膏得率按“干浸膏重量/藥材重量×100%”進(jìn)行計(jì)算，從不同提取方法可以看出水煎煮所得干浸膏明顯高于75%乙醇回流提取所得干浸膏，見表1。

紫丁香苷的含量測定：（1） 色譜條件。20RBAXSB-C18色譜柱，以甲醇∶水（18∶82）為流動(dòng)相，檢測波長265 nm，柱溫40℃。（2）標(biāo)準(zhǔn)品的制備。取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解，制成80μg/mL的溶液，即得。（3）樣品處理。分別稱取含有刺五加的干浸膏樣品0.1 g，加10ml 50%的甲醇溶解，超聲提取30min，取上清液10 000 rpm離心10min，過0.45μm濾膜，即得。（4）檢測結(jié)果。紫丁香苷是刺五加中成分，故未對烏梅干浸膏測定。從結(jié)果可以看出，刺五加、薏苡仁、酸棗仁水提取干浸膏中紫丁香苷含量最高，見表1。

表1 不同提取組分在水和75%乙醇提取的干浸膏得率及紫丁香苷含量

1.2.2 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)［11］（1）動(dòng)物分組。BALB/c小鼠64只，隨機(jī)分成8組，即A組為輻射模型對照組（生理鹽水組），B組為陽性藥物對照組（螺旋藻片組），C組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏組，D組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏另加烏梅水提取干浸膏組，E組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏組，F(xiàn)組為刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏另加烏梅75%乙醇提取干浸膏組，G組為刺薏復(fù)方四味藥水提取干浸膏組，H組為刺薏復(fù)方四味藥75%乙醇提取干浸膏組，每組小鼠8只。（2）給藥劑量。小鼠給藥量按成人劑量的15倍計(jì)，即按“成人生藥材處方量×干浸膏得率×15/ 60”進(jìn)行計(jì)算，各組給藥量見表2。螺旋藻片按成人劑量15倍的給藥量為1.13 g/kg）（螺旋藻片成人劑量是9片/d），灌胃時(shí)將藥物用飲用水溶解。（3）給藥方式。動(dòng)物于潔凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始給藥，于每天上午給藥1次，照射前給藥14 d，照射后給藥14 d。（4）造模方法。以Co60γ射線按4GY劑量全身照射小鼠一次，引起小鼠輻射損傷。

1.2.3 樣品采集和計(jì)數(shù)方法 分別于實(shí)驗(yàn)照射前、照射后第3天，照射后第14天三次采尾部末梢血10μl，每次采血后用5%火棉膠涂抹小鼠的尾部，將采取的血立即加入到裝有490μl的白細(xì)胞稀釋液的試管中，充分混勻后加入到血球計(jì)數(shù)板中于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

按 “四個(gè)大方格中白細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)× 107”計(jì)算血球計(jì)數(shù)板中白細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果如表2和圖1顯示，輻射前后外周血白細(xì)胞變化較大，說明輻射損傷模型已建立，組內(nèi)數(shù)據(jù)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)正態(tài)分布。藥物組，與生理鹽水組比較，B、D、F三組均在輻射后對小鼠的外周血白細(xì)胞有顯著性差異，其中D組在三個(gè)階段均有顯著性差異 （與生理鹽水組比較，P<0.05），其余各組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無較大差異。

表2 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細(xì)胞的影響（n=8，±s，109/L）

表2 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細(xì)胞的影響（n=8，±s，109/L）

注：與生理鹽水組比較，＊P<0.05，#P<0.01。

編號 劑量（g/kg） 照射前第3天 照射后第3天 照射后第14天A - 16.24±3.42 4.05±0.87 6.09±0.47 B 1.13 17.59±3.03 4.49±1.57 7.12±1.04＊C 2.00 18.55±1.42 5.16±1.14 6.41±2.00 D 3.00 21.63±3.06# 5.18±0.81＊ 7.18±1.09＊E 1.17 19.13±2.96 5.01±1.55 5.96±1.27 F 1.50 20.56±3.58＊ 4.83±0.87 6.98±0.83＊G 3.14 18.24±2.35 4.51±1.21 6.46±0.89 H 1.26 19.08±3.25 5.03±1.06 6.55±1.96

圖1 不同制備方法對輻射前后小鼠外周血白細(xì)胞的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)選擇了干浸膏得率和君藥刺五加中紫丁香苷含量［12］作為整方的提取控制指標(biāo)。不同提取方法研究顯示，水煎煮較75%乙醇回流提取干浸膏得率要高，考慮到后續(xù)制劑工業(yè)化生產(chǎn)，水煎煮提取是更理想的提取方式，此時(shí)紫丁香苷的含量為最高，又基于烏梅在煎煮過程中可能會(huì)影響復(fù)方中的化學(xué)成分，最好的提取方法就是刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥水提取干浸膏另加烏梅水提取干浸膏（簡稱“水3加1”）。從藥理作用效果來看，根據(jù)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，“水3加1”組和刺五加、薏苡仁、酸棗仁三味藥75%乙醇提取干浸膏另加烏梅75%乙醇提取干浸膏組均能顯著增加輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞的作用，表明其具有一定的抗輻射輔助作用，雖兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來看，“水3加1”組更明顯地增加了小鼠輻射后外周血白細(xì)胞的作用。因此，“水3加1”是刺薏復(fù)方最佳的提取方法以及在該制備下所得的藥物具有顯著增加小鼠輻射后外周血白細(xì)胞的作用。

該課題組前期研究表明薏苡仁中薏苡仁酯對輻射后小鼠外周血白細(xì)胞及胸腺脾臟具有一定的保護(hù)作用［10］，但由于薏苡仁酯屬于脂肪酸類衍生物，不易溶于水和乙醇，故薏苡仁酯的提取采用了超臨界二氧化碳萃取法［10］或乙酸乙酯浸提法［13］。在該實(shí)驗(yàn)中，研究重點(diǎn)是考察整方在水煎煮和75%乙醇回流提取下，刺薏復(fù)方對輻射后小鼠外周血白細(xì)胞的影響，為了考慮到薏苡仁酯可能對整方抗輻射產(chǎn)生協(xié)同作用，薏苡仁酯另行提取后按處方比加在復(fù)方提取物中進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，后續(xù)工作還有待進(jìn)一步進(jìn)行。

輻射與人們的生活、工作關(guān)系越來越密切，如經(jīng)常接觸輻射的工作人員、醫(yī)療上接受診斷和放化療患者、接觸礦物質(zhì)輻射的采礦工人，而現(xiàn)代生活接觸最普遍的就是計(jì)算機(jī)、手機(jī)、紫外線等一系列不可避免的輻射，直接或間接傷害人們的身體健康。人們對抗輻射的途徑有多種，如穿戴防護(hù)衣、出門攜帶防護(hù)傘等，但這些防護(hù)措施不僅給人們的生活帶來極大不便，而且從根本上消除不了輻射對機(jī)體的傷害。目前市場上抗輻射制劑較少，且效果多不盡如人意，而一些抗輻射合成藥物在給藥的同時(shí)也給機(jī)體帶來了不良反應(yīng)。中藥以其療效好、不良反應(yīng)小為特點(diǎn)，制成的制劑在市場上大受青睞，因此對中藥抗輻射復(fù)方制劑的研發(fā)刻不容緩。本實(shí)驗(yàn)選用臨床抗輻射有效復(fù)方，從藥物提取方法和抗輻射藥理篩選進(jìn)行研究，該研究主要為刺薏復(fù)方及其制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，為中藥抗輻射制劑的應(yīng)用帶來新市場前景。

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［2016－09－13收稿，2016－10－11修回］

［本文編輯：劉一洋］

The effect of different extracts of CiYi Compound on white cell of peripheral blood in radiated injury m ice

WU Ming-jiang①，AO Jing，ZHOU Min，et al.①Department of Pharmacy，Zunyi Academy of Medicine＆Drug，Zunyi，Guizhou 563002，China

ObjectiveTo study the effects of different extracts of CiYi compound on white cell of periphery blood in radiational injury mice.M ethodsThe drugs were extracted with water or 75%ethanol from CiYi compound respectively；the obtained dry extract yield and the content of syringin were used as the index of extraction.The BALB/c mice were exposed to 4GY Co60γ ray at one time on the 14th day after orally administered dry extracts of CiYi Compound and the change of white cells of periphery blood were compared on the third day before radiation，on the third day and 14th day after radiation.ResultsThe dry extract yield and the content of syringin of the water extract were higher than those of the 75%ethanol.The water extract of Wumei was added to other drugs of CiYi Compound could significantly increase white cells of periphery blood in radiational injury mice.ConclusionThe water extract（Wumei alone water added to compoand water）of CiYi Compound can increase white cells of periphery blood in mice after radiation.

CiYi Compound；Extraction；Anti-radiation；White cell of peripheral blood

R931.71

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.04.023

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字［2015］7577號）

563002貴州遵義，遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系（伍明江，周敏）；遵義市第一人民醫(yī)院乳甲科（敖靜）；550002貴州貴陽，貴陽中醫(yī)學(xué)院制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（蔣朝暉，吳曉黎）