張旭升，黃戰(zhàn)軍，曾憲欽，朱平先，蔡博治，張勇剛

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

高尿酸血癥對(duì)血管鈣化作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)性研究＊

張旭升，黃戰(zhàn)軍＊，曾憲欽，朱平先，蔡博治，張勇剛

目的 觀察高尿酸血癥對(duì)大鼠血管鈣化的影響。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（大鼠28只）隨機(jī)分正常組、高尿酸血癥組、鈣化組和鈣化+高尿酸血癥組，每組7只，鈣化組采用維生素D3（300 000 U/kg，1次，肌肉注射）和尼古?。?5mg/kg溶于花生油中早、晚各灌胃1次）建立大鼠血管鈣化模型，高尿酸組采用2%氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)高尿酸血癥模型，分別用苦味酸法和尿酸氧化酶過(guò)氧化物酶法檢測(cè)大鼠血清尿酸和肌酐濃度，用Von Kossa染色檢測(cè)血管鈣化程度，用鈣離子測(cè)試盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒測(cè)定大鼠主動(dòng)脈鈣含量和ALP活性，用硝酸還原酶法檢測(cè)大鼠血漿NO含量。結(jié)果 維生素D3和尼古丁能夠誘導(dǎo)典型大鼠血管鈣化模型，2%氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)可誘導(dǎo)高尿酸血癥模型，Von Kossa染色示鈣化組主動(dòng)脈有大量黑色顆粒沉淀，并且血管鈣含量、ALP活性明顯高于正常組，鈣化組+高尿酸血癥組鈣化最為明顯；三組實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿NO的表達(dá)較正常組明顯下調(diào)。結(jié)論 高尿酸血癥促進(jìn)大鼠血管鈣化，可能與下調(diào)NO的表達(dá)和上調(diào)ALP活性有關(guān)。

高尿酸血癥；血管鈣化；NO；大鼠

血管鈣化是指血管壁鈣鹽的過(guò)量沉積，與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動(dòng)的、可調(diào)節(jié)的過(guò)程［1］，許多血管活性因子參與血管鈣化的過(guò)程，但具體機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，血管鈣化是導(dǎo)致臨床心血管事件的重要危險(xiǎn)因素，常見(jiàn)于冠心病、糖尿病及慢性腎病等，因此，闡明血管鈣化機(jī)制并為防治血管鈣化提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)是目前面臨的重要課題之一。高尿酸血癥是臨床上常見(jiàn)的獨(dú)立心血管危險(xiǎn)因素，研究證明它參與動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生過(guò)程，尤其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［2］，但是否促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，為此，本研究在動(dòng)物模型上觀察高尿酸血癥對(duì)大鼠血管鈣化的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品雄性SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，約6～8周齡，160～180 g。維生素D3購(gòu)自Sigma公司，尼古丁購(gòu)自Merck公司，純度>95%；氧嗪酸鉀購(gòu)自開(kāi)封市行知生物科技有限公司，純度>95%；2%氧嗪酸鉀飼料由北京華阜康生物技術(shù)有限公司配制，鈣離子測(cè)試盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatases，ALP）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；NO試劑盒購(gòu)自北京華英生物研究所。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 鈣化動(dòng)物模型制備28只雄性SD大鼠隨機(jī)分4組，每組7只，分別為正常對(duì)照組，鈣化組，高尿酸血癥組，鈣化組+高尿酸血癥組。鈣化組：第1天早8：00予維生素D3肌肉注射 （300 000U/kg體重），尼古丁灌胃（25mg/kg，溶于花生油），晚18：00尼古丁重復(fù)灌胃一次。正常對(duì)照組：大鼠予等量生理鹽水肌肉注射和單純花生油灌胃。 高尿酸組：采用2%氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)高尿酸血癥模型。鈣化組+高尿酸血癥組：在鈣化組基礎(chǔ)上加用2%氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)。4 w后稱重，3%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血處死，將血置入含有EDTA和抑肽酶的試管中，4℃離心分離血漿，-80℃保存。摘取主動(dòng)脈組織，用冰生理鹽水沖洗后，切取部分主動(dòng)脈組織，石蠟包埋，染色，其余組織-80℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3 Von Kossa染色取石蠟包埋的大鼠胸主動(dòng)脈段，制作4μm切片，常規(guī)脫蠟、脫水。浸入1%硝酸銀溶液，在紫外線下照射30min后，將切片浸入5%硫代硫酸鈉溶液中1min，最后用0.25%堿性品紅返染。經(jīng)脫水、透明、封片后，光鏡下觀察血管鈣鹽的沉積。

1.4 血管組織ALP活性及鈣含量測(cè)定將大鼠主動(dòng)脈組織約50mg，勻漿后，4℃離心，先取上清以考馬斯亮藍(lán)法行蛋白定量，再分別按照ALP測(cè)定試劑盒（磷酸苯二鈉法）及鈣測(cè)試盒（甲基百里香酚藍(lán)比色法）說(shuō)明書(shū)測(cè)定勻漿液ALP活性及鈣含量。

1.5 血漿NO含量的測(cè)定取血漿約200μl，采用硝酸還原酶法測(cè)定血漿NO含量，具體步驟按NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 血清尿酸和肌酐的測(cè)定取血清約200μl，送汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，分別用苦味酸法和尿酸氧化酶過(guò)氧化物酶法檢測(cè)大鼠血清尿酸和肌酐濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graph Pad Prism 4統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血管鈣化的特征用Von Kossa染色可觀察到鈣化組和鈣化+高尿酸血癥組主動(dòng)脈中膜彈性纖維間黑色顆粒沉積，表明鈣鹽沉積，鈣化+高尿酸血癥組鈣鹽沉積尤為明顯，而正常組和單純高尿酸血癥組均未見(jiàn)鈣鹽沉積。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈Von Kossa染色，黑色顆粒為鈣鹽沉積（×100）

2.2 大鼠主動(dòng)脈組織鈣含量及堿性磷酸酶活性變化鈣化組和鈣化+高尿酸血癥組血管鈣含量及堿性磷酸酶活性明顯高于正常組和單純高尿酸血癥組（P<0.01），以鈣化+高尿酸血癥組最為明顯。見(jiàn)表1。

表1 主動(dòng)脈鈣含量與血管ALP活性比較（±s）

表1 主動(dòng)脈鈣含量與血管ALP活性比較（±s）

注：與正常組比較，＊P<0.01；與高尿酸血癥組比較，#P<0.01。

血管ALP（U/g蛋白）正常組 7 0.46±0.15 109.80±16.50鈣化組 7 0.88±0.06＊ 196.00±16.43＊#高尿酸血癥組 7 0.47±0.15 105.90±18.19鈣化+高尿酸血癥組 7 1.08±0.08＊ 262.80±65.15＊#組別 n 血管鈣含量（mmol/g蛋白）

2.3 大鼠血清尿酸、肌酐及血漿NO濃度的變化見(jiàn)表2。

表2 血清尿酸、肌酐和血漿NO濃度的變化（±s）

表2 血清尿酸、肌酐和血漿NO濃度的變化（±s）

注：與正常組比較，＊P<0.01；△P<0.05；與鈣化組比較，#P<0.01。

NO（μmol/L）正常組 7 22.29±9.71 28.57±5.77 68.96±3.35鈣化組 7 21.57±7.21＊43.57±10.44＊63.60±5.29高尿酸血癥組 7 75.00±10.07 36.43±4.28△ 49.39±1.16＊#鈣化+高尿酸血癥組 7 121.90±21.51＊59.00±14.92＊48.03±2.22＊#組別 n 尿酸（μmol/L）肌酐（μmol/L）

3 討論

許多研究表明，血管鈣化與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動(dòng)的、可調(diào)節(jié)的過(guò)程，與骨組織的骨化過(guò)程相似，包括基質(zhì)小泡的出現(xiàn)、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性的增加，其中最重要的特征是血管平滑肌細(xì)胞由收縮型表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞表型，并分泌多種骨相關(guān)蛋白和活性因子，使血管發(fā)生鈣化。在病理情況下如氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等，可導(dǎo)致血管損傷，激活多條信號(hào)通道包括TGF-β/BMPs/Smad通路和MAPK通路等［3，4］，促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展。因此，血管鈣化的調(diào)節(jié)受促進(jìn)血管鈣化因子與抑制血管鈣化因子的相互作用影響。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)salusinβ、醛固酮和部分炎癥因子等活性因子的表達(dá)均與血管鈣化的程度呈正相關(guān)［5-7］，提示其有促進(jìn)血管鈣化的作用。促進(jìn)血管鈣化因子之間對(duì)血管鈣化的發(fā)展有協(xié)同作用，并可通過(guò)下調(diào)抑制血管鈣化因子如intermedin［8］而削弱其保護(hù)血管功能的作用，從而加速血管鈣化的進(jìn)展。大量前瞻性流行病調(diào)查研究表明，高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)的重要原因，而且是許多心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［9］。高尿酸血癥可以損傷血管并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，是否促進(jìn)血管鈣化尚不清楚。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大劑量維生素D3合用尼古丁可造成主動(dòng)脈中膜鈣鹽沉積，并且主動(dòng)脈組織鈣含量增加，ALP活性上調(diào)，提示典型血管鈣化模型成功建立。采用2%氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)四周亦可建立穩(wěn)定的高尿酸血癥動(dòng)物模型。鈣化組和鈣化組+高尿酸血癥組血管鈣含量、ALP活性明顯高于正常組和單純高尿酸血癥組，且鈣化組+高尿酸血癥組鈣化最為明顯，而單純高尿酸血癥組未顯示血管鈣化傾向，提示高尿酸血癥不是血管鈣化的始動(dòng)因子，而是促進(jìn)血管鈣化因子。

多項(xiàng)研究表明，尿酸與血管損傷尤其在動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切，可能機(jī)制與尿酸損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并使NO合成減少［2，10］和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等相關(guān)［11］。而NO是在NO合成酶作用下，催化左旋精氨酸轉(zhuǎn)變成L-瓜氨酸而生成，血漿NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌，是反映血管內(nèi)皮功能的主要指標(biāo)之一。三組實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿NO的表達(dá)較正常組明顯減少，高尿酸血癥組和鈣化+高尿酸血癥組鈣化最為明顯，且兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而鈣化組血清尿酸輕度減少，但與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明高尿酸血癥可損傷血管內(nèi)皮功能，從而使內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO減少，而單純血管鈣化未能明顯影響內(nèi)皮功能，提示尿酸促進(jìn)血管鈣化的可能機(jī)制與其損傷血管內(nèi)皮功能相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥和鈣化大鼠腎功能輕度異常，與本課題組前期研究和其他相關(guān)研究結(jié)果相符［12，13］，且鈣化+高尿酸血癥組腎功能異常最為明顯，可能機(jī)制與尿酸、血管鈣化協(xié)同損傷腎微血管有關(guān)，而腎功能不全亦有可能加重血管鈣化的進(jìn)展。

該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥是一個(gè)新的促進(jìn)血管鈣化的因子，可能機(jī)制與尿酸損傷血管內(nèi)皮功能使NO表達(dá)減少、上調(diào)ALP活性及損傷腎功能等相關(guān)，確切分子學(xué)機(jī)制和可能涉及的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究，但仍能為臨床防治血管鈣化提供一種新的策略與靶點(diǎn)。

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［2016－09－12收稿，2016－10－10修回］

［本文編輯：韓仲琪］

Effect and mechanism of hyperuricem ia on vascular calcification in model of rats

ZHANG Xü-sheng①，HUANG Zhan-jun，ZENG Xian-qin，et al.①Department of Cardiology，Longgang District's People's Hospital of Shenzhen，Shenzhen，Guangdong 518172，China

ObjectiveTo observe the effect of hyperuricemia in vascular calcification model of rats.M ethodsRats（n=28） were random ly divided into normal，hyperuricemia，calcification and calcification plus hyperuricemia groups（n=7，for each group）.Calcification group was induced by a single dose intramuscular injection of vitamin D3（300 000U/kg）plus nicotine（25mg/kg dissolved in peanut oil）gavage in the morning and evening.Hyperuricemia group was induced by 2%oteracil potassium feed.The concentration of uric acid and creatinine in serum were detected by picric acid method and uric acid enzyme peroxidase respectively.Vascular calcification was determined by Von Kossa staining，calcium content and alkaline phosphatase（ALP）activity were detected by using calcium assay kit and alkaline phosphatase detection kit respectively，and NO content in the plasma was detected by nitrate reductase assay.ResultsTypical vascular calcification model of rats were induced by vitamin D3and nicotine，and the hyperuricemia model of rats were induced by 2%oxygen potassium feed too. Von Kossa staining showed that mass black granule deposited in aorta of calcification model of rats，calcium content and alkaline phosphatase（ALP）activity in calcified group were increased significantly than those in the normal group，and the degree of calcification in calcification plus hyperuricemia groups was the most obvious.and the expression of NO in plasma of the three groups was down-regulated significantly compared with those in the normal group.ConclusionHyperuricemia promotes vascular calcification in rats，which may be related to the down-regulation of NO expression and up-regulation of ALP activity.

Hyperuricemia；Vascular calcification；NO；Rat

R543

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.04.022

深圳市龍崗區(qū)創(chuàng)新科研基金資助項(xiàng)目（YLW20150514 114556218）

518172廣東深圳，深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（張旭升，黃戰(zhàn)軍，曾憲欽，朱平先）；515041廣東汕頭，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院分子心臟病學(xué)實(shí)驗(yàn)室 （蔡博治）；515021廣東汕頭，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科（張勇剛）

黃戰(zhàn)軍，Email：CharlesHZJ@163.com