張保平，李 娜，高惠林，王前光，任國(guó)冀，童學(xué)勤

(1.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理學(xué)院 動(dòng)物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源縣堆金豪豬養(yǎng)殖基地，湖南 桃源 415000)

抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的制備及抑菌性研究

張保平1，李 娜2*，高惠林1，王前光1，任國(guó)冀1，童學(xué)勤3

(1.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理學(xué)院 動(dòng)物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源縣堆金豪豬養(yǎng)殖基地，湖南 桃源 415000)

本試驗(yàn)采用甲醛滅活仔豪豬腹瀉大腸埃希菌作為免疫抗原，翅靜脈注射免疫140日齡桃源蛋雞，使機(jī)體免疫應(yīng)答生成血清抗體和卵黃抗體，利用平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)抗體滴度，研究獲得含高滴度血清和高免雞蛋的最佳條件。結(jié)果表明，翅靜脈注射大腸桿菌液最佳免疫劑量是每次1 mL，菌液濃度是1×1012mL-1。在大腸桿菌液中添加等劑量完全弗氏佐劑對(duì)免疫應(yīng)答增強(qiáng)的程度最高。免疫強(qiáng)化程序能有效增強(qiáng)產(chǎn)蛋雞的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，初免以后，每隔1天強(qiáng)化免疫1次，連續(xù)4次免疫，效果最好。體外抑菌性試驗(yàn)結(jié)果表明,制備的卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌具有明顯抑制其生長(zhǎng)的作用，但是對(duì)沙門氏菌的抑制作用比較小。本研究制備的卵黃抗體滴度和血清抗體滴度變化幅度小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性好，為臨床上防治仔豪豬腹瀉大腸埃希菌病提供新的手段。

大腸埃希菌； 豪豬； 卵黃抗體； 制備； 抑菌性

豪豬(porcupines)，又稱箭豬、刺豬。在動(dòng)物分類學(xué)上屬于哺乳綱、嚙齒目、豪豬科[1- 3]，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的珍稀動(dòng)物，具有食用價(jià)值、藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值[4- 5]。豪豬的抗病能力很強(qiáng)，很少發(fā)生疾病，仔豪豬腹瀉是引起豪豬死亡的主要病因。

雞卵黃抗體(IgY)是蛋雞受免疫刺激后，雞體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血液中免疫球蛋白G(IgG)被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中唯一的免疫球蛋白類[6]。與哺乳動(dòng)物的IgG相比，雞蛋的IgY具有取材方便、提取方法比較簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)。可作為口服劑或飼料添加劑用于預(yù)防和治療動(dòng)物早期的消化道疾病[7]。

我國(guó)豪豬的養(yǎng)殖尚處于起步階段,對(duì)豪豬的研究主要在繁殖、營(yíng)養(yǎng)和生理等方面[8- 10]，有關(guān)豪豬疾病防治的研究報(bào)道較少。本研究以仔豪豬腹瀉大腸埃希菌為抗原，篩選獲得含有高效價(jià)抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的免疫雞蛋的最佳條件，并在體外研究抗仔豪豬大腸埃希菌卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌和沙門氏菌生長(zhǎng)的抑制作用,從而為大量制備特異性卵黃抗體防治仔豪豬大腸埃希菌腹瀉病提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純種桃源蛋雞，140日齡，購(gòu)自桃源縣良種場(chǎng)。試驗(yàn)期間試驗(yàn)雞日常管理與衛(wèi)生防疫按常規(guī)進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

仔豪豬腹瀉大腸埃希菌(E.coli)菌株和沙門氏菌(Salmonella)：常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程系微生物實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定，并傳代培養(yǎng)得到[11]。

1.1.3 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、三氯甲烷、硫酸銨(分析純)等，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物有限責(zé)任公司；10號(hào)白油(食品級(jí))、司班- 80、硬脂酸鋁、磷酸氫鈉(分析純)等，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑總廠；卡拉膠，低甲氧基果膠和氯化鈣，購(gòu)自天津市福辰化學(xué)試劑廠。

1.1.4 主要儀器

立式高壓蒸汽滅菌鍋，購(gòu)自上海東亞壓力容器制造公司；分光光度計(jì)、生化培養(yǎng)箱、干燥箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平，購(gòu)自北京賽多利斯儀器有限公司；超凈臺(tái)，購(gòu)自中國(guó)上海浦東物理光學(xué)儀器廠；醫(yī)用血球計(jì)數(shù)板，購(gòu)自江蘇醫(yī)用電子儀器公司；注射器，購(gòu)自成都市雙流雙陸醫(yī)療器械公司；冰箱，購(gòu)自青島海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基與免疫佐劑配制方法

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：按常規(guī)方法[12]制備，高壓滅菌，置4 ℃冰箱中保存，備用。

白油佐劑：取96 mL 的10號(hào)白油放入燒杯中，文火加熱，當(dāng)溫度達(dá)160 ℃以上時(shí)，邊攪拌邊加入56 ℃水浴中預(yù)熱30 min的司班- 80 2 mL和硬脂酸鋁4 g，當(dāng)后者完全溶解，混合液呈透明膠凍狀，小量分裝，高壓滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗原制備

將仔豪豬腹瀉大腸埃希菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2)，小心沖洗菌苔，調(diào)成濃度為1×1012mL-1菌液，再加甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃滅活24 h。在此過程中每隔2 h搖勻一次。滅活完畢4 ℃保存。

取滅活的大腸埃希菌液分別與等量佐劑混合乳化。當(dāng)溶液乳化至滴在水面上呈“油包水”狀，即合格。否則繼續(xù)乳化。3種佐劑(完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和白油佐劑)與滅活菌的乳化制備方法相同。4 ℃保存。

1.2.3 產(chǎn)蛋雞免疫方案

桃源蛋雞分組，每組6只，分兩籠飼養(yǎng)。按照免疫抗原的不同劑量、不同佐劑種類和不同間隔時(shí)間等3種免疫強(qiáng)化方式分組。

不同劑量的免疫抗原：分3組，菌體濃度依次是1×1010、1×1012和1×1014mL-1。

不同佐劑依次是完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號(hào)白油3個(gè)組。

免疫強(qiáng)化方式分組，程序1：初免1次，無免疫強(qiáng)化。程序2：初免后每隔1 d免疫強(qiáng)化1次，連續(xù)4 次。程序3：初免后每隔2 d免疫強(qiáng)化1次，連續(xù)4 次。

1.2.4 高免卵黃抗體制備

收集未免疫雞蛋，初次免疫接種當(dāng)天記為0 d，以后每隔7 d收集免疫蛋作樣本，依次編號(hào)記錄，4 ℃保存。連續(xù)收集9次。同時(shí)設(shè)未免疫對(duì)照組，注射PBS乳化劑。

先將收集的雞蛋用清水洗凈，再噴灑0.1%新潔爾滅消毒，無菌收集卵黃。分離卵黃與等量PBS混勻，然后加4倍體積的脫脂溶液[13](含0.06%的卡拉膠，0.18%的低甲氧基果膠和10 μmol·L-1氯化鈣)混勻，12 000 r·min-1、4 ℃離心25 min，取上清；再加硫酸銨至終濃度33%(m/V)，混勻，4 ℃ 1 h，12 000 r·min-1離心25 min，取沉淀用PBS溶解，加入硫酸銨至終濃度20%(m/V)，混勻，放于透析袋透析，無菌過濾后加0.01%硫柳汞和青鏈霉素1 000 IU·mL-1，小量分裝，-20 ℃保存。

1.2.5 蛋雞血清制備

免疫前1 d采血。免疫后每隔7 d，自雞翅靜脈采血1 mL。分離血清，3 500 r·min-1離心5 min除紅細(xì)胞。標(biāo)記，置-20 ℃凍存。連續(xù)采血9次。

1.2.6 抗體效價(jià)測(cè)定

采用平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。96孔“V”型微量血凝板中每孔加入滅菌生理鹽水25 μL，再吸抗體25 μL加入第1孔中，混勻，吸混合液25 μL于第2孔，混勻，吸混合液25 μL于第3孔。依次倍比稀釋至256倍(即第8孔，多余25 μL溶液吸棄)。留第9孔作空白對(duì)照，加滅菌生理鹽水25 μL。每孔加仔豪豬腹瀉E.coli抗原(含菌量為1×1012mL-1)25 μL，混勻各孔中溶液(每孔更換槍頭)，微量血凝板放振蕩器上震蕩，2～3 min后，記錄每孔凝集現(xiàn)象。對(duì)照孔溶液應(yīng)為均勻渾濁。與對(duì)照孔中溶液一樣渾濁者判定為無凝集反應(yīng)，記為-。凡是孔中溶液有肉眼可見絮狀凝集塊者，判定為有凝集反應(yīng)，記錄為+。絮狀凝集塊愈多，陽(yáng)性反應(yīng)判定為愈強(qiáng)，分別用++、+++和++++表示。凡發(fā)生凝集反應(yīng)結(jié)果判定為++的最高稀釋度即是該樣本抗體效價(jià)。效價(jià)用log2x(x為稀釋倍數(shù))表示。

1.2.7 卵黃抗體的抑菌性檢測(cè)

以實(shí)驗(yàn)室自行分離保存的致病性大腸埃希菌和沙門氏菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行體外抑菌性試驗(yàn)，具體試驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，并稍加改進(jìn)。取3只試管，每只內(nèi)裝牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基8 mL。先在每個(gè)試管中加入大腸埃希菌指示菌懸液1 mL，再向其中2支試管各加入1 mL不同濃度的卵黃抗體，使卵黃抗體的最終濃度分別達(dá)到1 mg·mL-1和10 mg·mL-1。另外的1支試管中加入1 mL滅菌的生理鹽水作為陰性對(duì)照。同樣方法操作沙門氏菌。將6只試管放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在1、5、8、21、25和29 h各取1 mL培養(yǎng)液，用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)檢測(cè)樣本的吸光度D值。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫菌液濃度對(duì)卵黃抗體效價(jià)和雞血清抗體的影響

不同濃度(含菌數(shù)1×1010mL-1、1×1012mL-1和1×1014mL-1)的大腸桿菌懸浮液1 mL分別免疫蛋雞，無佐劑，經(jīng)翅靜脈注射1次，免疫后特定時(shí)間收蛋和采血，測(cè)定卵黃抗體和血清抗體效價(jià)，結(jié)果如圖1中A和B所示。

圖1 抗原免疫菌液濃度對(duì)卵黃抗體(A)和雞血清抗體(B)效價(jià)的影響

從圖1中A看出，不同濃度菌液免疫的雞蛋，其卵黃抗體的效價(jià)有較大差異。1×1010mL-1菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價(jià)明顯低于1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的雞蛋。但對(duì)1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價(jià)差別不明顯。

從圖1中B和A對(duì)比可知，同等條件下，被免疫雞的血清抗體效價(jià)比卵黃抗體效價(jià)要略高一些。但就變化趨勢(shì)看，卵黃抗體效價(jià)與血清抗體效價(jià)的變化規(guī)律基本相同，均呈先上升，再平穩(wěn)，后下降的趨勢(shì)，并且基本同步。因此，選擇注射菌液濃度1×1012mL-1的大腸桿菌懸浮液1 mL作為最佳免疫劑量。

2.2 不同免疫佐劑對(duì)卵黃抗體和雞血清抗體效價(jià)的影響

對(duì)蛋雞注射菌液濃度是1×1012mL-1菌懸浮液1 mL，添加不同佐劑(完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號(hào)白油)，經(jīng)翅靜脈免疫注射1次，免疫后不同時(shí)間收蛋和采血測(cè)卵黃抗體和血清抗體效價(jià)。同時(shí)無佐劑免疫組同步免疫，作陰性對(duì)照。結(jié)果如圖2中A和B所示。

圖2 3種不同免疫佐劑對(duì)卵黃抗體(A)和雞血清抗體(B)效價(jià)的影響

圖2中A和B是3種免疫佐劑對(duì)卵黃抗體和雞血清抗體效價(jià)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，佐劑的添加均可在一定程度上提高卵黃抗體和血清抗體的效價(jià)。但從3種佐劑產(chǎn)生的免疫應(yīng)答看，完全弗氏佐劑效果最好，不完全弗氏佐劑和白油佐劑效果略差，后兩者對(duì)免疫應(yīng)答的加強(qiáng)作用差異不明顯。添加完全弗氏佐劑后，可使第6周收集的免疫蛋卵黃抗體效價(jià)從3log2上升到5log2，同時(shí)第6周采集的血清抗體效價(jià)從4log2上升至7log2，增加幅度明顯。因此在制備免疫原時(shí)選擇大腸埃希菌懸液與完全弗氏佐劑等量混合。

2.3 不同強(qiáng)化免疫程序?qū)β腰S抗體和雞血清抗體效價(jià)的影響

給蛋雞免疫濃度是1×1012mL-1菌懸液1 mL，添加等量完全弗氏佐劑，經(jīng)翅靜脈注射，不同程序強(qiáng)化免疫，免疫后不同時(shí)間收蛋和采血，測(cè)卵黃抗體和血清抗體效價(jià)，結(jié)果如圖3中A和B所示。

圖3中A和B是不同強(qiáng)化免疫程序?qū)β腰S抗體和血清抗體效價(jià)的影響。結(jié)果顯示，與未進(jìn)行免疫強(qiáng)化的程序1相比，兩種免疫強(qiáng)化的程序2和3均可明顯提高卵黃抗體和血清抗體效價(jià)。重要的是，在未進(jìn)行免疫強(qiáng)化的雞血清和卵黃中，其抗體效價(jià)分別在第8周和第9周明顯下降，但免疫強(qiáng)化后，下降趨勢(shì)或者被推遲出現(xiàn)或者被完全消除。對(duì)比3種免疫程序，發(fā)現(xiàn)程序2和3在效果上差異不明顯，因此，為節(jié)約時(shí)間，可選擇采用免疫強(qiáng)化程序2對(duì)蛋雞免疫。

2.4 卵黃抗體的活性測(cè)定

2.4.1 卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌的抑菌性測(cè)定結(jié)果

制備的卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌在生長(zhǎng)的早期具有明顯的抑制作用,試驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組的D值具有明顯差異,但是在24 h以后，卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌的抑制作用下降。結(jié)果見圖4中A。

2.4.2 卵黃抗體對(duì)沙門氏菌的抑菌性測(cè)定結(jié)果

制備的卵黃抗體對(duì)沙門氏菌在生長(zhǎng)的過程中具有一定的抑制作用,但是較大腸桿菌小。結(jié)果見圖4中B。

圖3 免疫程序?qū)β腰S抗體(A)和雞血清抗體(B)效價(jià)的影響

圖4 不同濃度的卵黃抗體對(duì)大腸埃希菌(A)和沙門氏桿菌(B)的抑菌作用

3 討論

免疫蛋的制備，實(shí)質(zhì)上是對(duì)蛋雞進(jìn)行抗原免疫，讓其在血液中產(chǎn)生的抗體轉(zhuǎn)化到蛋黃中貯藏而形成含有較高特異性抗體濃度的雞蛋。研究顯示，抗原進(jìn)入機(jī)體要經(jīng)過一個(gè)潛伏期才開始發(fā)生免疫作用，細(xì)菌抗原多是5～7 d。本研究結(jié)果表明，免疫初期，免疫組與對(duì)照組卵黃抗體效價(jià)和血清抗體效價(jià)均無明顯差別，說明是處在免疫潛伏階段。

動(dòng)物在受到抗原刺激后，在免疫應(yīng)答不同階段所產(chǎn)生的抗體類別是有差異的。初次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體水平不高，IgG很少，多數(shù)為IgM。但免疫加強(qiáng)后，抗體效價(jià)增高迅速，產(chǎn)生抗體則主要為IgG，而IgM很少。此現(xiàn)象的原因是記憶細(xì)胞開始重新分化、增殖，產(chǎn)生大量抗體。本文研究也印證了這一點(diǎn)，在免疫加強(qiáng)后，卵黃抗體和血清抗體效價(jià)均有大幅度升高現(xiàn)象。

以仔豪豬大腸埃希菌懸浮液對(duì)140日齡純種桃源蛋雞免疫時(shí)，若固定免疫抗原劑量為1 mL，則當(dāng)菌液濃度低于1×1012mL-1時(shí)，免疫應(yīng)答強(qiáng)度隨免疫劑量的降低而降低；當(dāng)菌液濃度高于1×1012mL-1時(shí)，免疫應(yīng)答強(qiáng)度則不會(huì)隨免疫劑量的增加而得到明顯增強(qiáng)。據(jù)此確定免疫菌液濃度是1×1012mL-1，劑量定為每次1 mL。在菌懸液中分別添加等量完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號(hào)白油佐劑免疫蛋雞時(shí)，均可明顯加強(qiáng)雞體免疫應(yīng)答強(qiáng)度，其中完全弗氏佐劑對(duì)免疫應(yīng)答加強(qiáng)的程度最高，且對(duì)受試動(dòng)物無不良作用。初免后，每隔1 d強(qiáng)化免疫1次，連續(xù)4次的強(qiáng)化免疫程序既經(jīng)濟(jì)又有效。

體外抑菌性作用的試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的卵黃抗體對(duì)大腸桿菌在生長(zhǎng)的早期具有明顯的抑制作用，試驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組的D值具有明顯差異，但是在24 h以后，卵黃抗體對(duì)大腸桿菌的抑制作用下降。對(duì)沙門氏菌在生長(zhǎng)的過程中具有一定的抑制作用,但是作用不是非常明顯。

本文研究了仔豪豬腹瀉大腸埃希菌高免卵黃抗體及免疫雞血清抗體的變化規(guī)律，制備出了高效價(jià)的卵黃抗體和血清抗體。免疫后高效價(jià)卵黃抗體可以維持4周以上。試驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用雞源高效卵黃抗體防治仔豪豬大腸埃希菌腹瀉病研究提供了技術(shù)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。

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(責(zé)任編輯：盧福莊)

2016- 12- 18

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目“桃源豪豬健康養(yǎng)殖示范推廣及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)”(2015GA770010);湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(12C0974;14C0805); 湖南省常德市科技計(jì)劃(2012CK03、2011CK01);湖南文理學(xué)院生科學(xué)院2016年省級(jí)平臺(tái)開放科研項(xiàng)目(SKYPT201607)

張保平(1978—)，男，內(nèi)蒙古人，講師，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作，E- mail：bpzhang2007@126.com。

李 娜(1977—)，女，講師，碩士，從事動(dòng)物病原微生物與免疫學(xué)研究工作，E- mail：vetlina@126.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170339

S858.9；S852.4

A

0528- 9017(2017)03- 0484- 05

文獻(xiàn)著錄格式：張保平，李娜，高惠林，等. 抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的制備及抑菌性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(3)：484- 488.