呂曉業(yè)，王健，李昕宇，蒲文淵，黃芳，王芃，周建光，李山虎，衛(wèi)勃

1.解放軍總醫(yī)院 普外科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京100850；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 十堰 442000；4.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，海南 ?？?570228

敲低CXCR4表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞HGC27的增殖

呂曉業(yè)1，王健2，李昕宇3，蒲文淵4，黃芳2，王芃2，周建光2，李山虎2，衛(wèi)勃1

1.解放軍總醫(yī)院 普外科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京100850；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 十堰 442000；4.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，海南 海口 570228

目的：初步探索CXCR4與胃癌細(xì)胞HGC27增殖的關(guān)系。方法：構(gòu)建攜帶CXCR4短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒載體質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48 h后收集上清感染HGC27細(xì)胞，用Western印跡鑒定其干擾CXCR4蛋白表達(dá)的效果，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測敲低CXCR4表達(dá)對HGC27細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：雙酶切鑒定和基因測序表明敲低CXCR4慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功；慢病毒感染后有效抑制HGC27細(xì)胞中CXCR4蛋白水平，敲低CXCR4表達(dá)對HGC27細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。結(jié)論：CXCR4參與了胃癌細(xì)胞HGC27的增殖，提示CXCR4有望成為一個(gè)新的胃癌治療靶點(diǎn)。

CXCR4；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1；胃癌；HGC27細(xì)胞

胃癌是常見的腫瘤之一，其導(dǎo)致的死亡率在各類腫瘤中高居第三位[1-2]。我國因受飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境污染、醫(yī)療條件等諸多因素的影響，胃癌的發(fā)生率與病死率均高居前列[3]。因此，了解與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，對于進(jìn)行早期預(yù)測與干預(yù)、制定治療方案，以及改善患者的預(yù)后均十分有利。近年來，炎性趨化因子及其受體與胃癌相關(guān)性的研究逐漸成為熱點(diǎn)[4]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）屬于趨化因子CXC亞家族，最早被Nagasawa等[5]發(fā)現(xiàn)，其受體CXCR4（由352個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成）是一種7次跨膜的視紫紅質(zhì)樣的G蛋白偶聯(lián)受體，其N端與SDF-1結(jié)合后可啟動(dòng)下游信號通路，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多項(xiàng)功能的調(diào)控[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4軸和胃癌的發(fā)生發(fā)展過程具有一定的關(guān)聯(lián)性，而我們的工作證明了在胃癌細(xì)胞HGC27中敲低CXCR4蛋白的表達(dá)對細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，因而有望成為一個(gè)新的胃癌治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、HGC27細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存［在37℃、5%CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（50 U/mL氨芐西林、100 U/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)］；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ和BamHⅠ購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR回收試劑盒及膠回收試劑盒購自康寧生命科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；γ-tubulin抗體購自Santa Cruz公司；CXCR4抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI為本實(shí)驗(yàn)室保存；Cell Counting Kit 8（CCK8）試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 干擾CXCR4表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建與鑒定

根據(jù)CXCR4的基因序列，設(shè)計(jì)干擾CXCR4表達(dá)的短發(fā)夾RNA（shRNA）引物shCXCR4-F（5'-CCGGGCTGCCTTACTACATTGGGATCTGCAGATCC CAATGTAGTAAGGCAGCTTTTTG-3'）和shCXCR4-R（5'-AATTCAAAAAAAGCTGCCTTACTACATTGG GATCTGCAGATCCCAATGTAGTAAGGCGGCAGC-3'），并將2條單鏈退火；載體pLKO.1經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切（37℃，2 h）后切膠回收，再將退火后帶有粘性末端的CXCR4雙鏈shRNA序列連入pLKO.1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后培養(yǎng)擴(kuò)增，挑取單克隆，用含氨芐西林的LB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆測序。

1.3 慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染前24 h將293T細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種量控制在60%～70%，轉(zhuǎn)染前2 h更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G和敲除質(zhì)粒pLKO.1-CXCR4按3∶1∶2的比例、將轉(zhuǎn)染試劑PEI和DMEM按1 μg∶1 μL的比例稀釋，各靜置5 min后混合，再次靜置30 min后滴入293T細(xì)胞，用同樣的方法轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，12 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液，48 h后收取病毒上清并過濾，將分裝后的病毒液放置-80℃保存。

1.4 病毒感染HGC27細(xì)胞

感染前24 h將HGC27細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種量控制在60%～70%，感染時(shí)將5 mL病毒上清、5 mL培養(yǎng)液和10 μL 10 ng/mL的聚凝胺（polybrene）混勻后滴入HGC27細(xì)胞，12 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液，48 h用嘌呤霉素篩選。

1.5 Western印跡檢測

收集蛋白樣品，加入5×SDS緩存液，煮沸10 min后行SDS-PAGE，再濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上，用5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，4℃孵育稀釋的一抗搖床過夜；用TBST洗膜液洗膜3次，每次7 min；室溫下孵育稀釋的二抗6 h，之后用TBST洗膜3次，每次7 min；滴加發(fā)光液后在暗室中顯影、定影。

1.6 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將CXCR4敲低的HGC27細(xì)胞和對照細(xì)胞分別接種至96孔板中，接種密度為2000/孔，重復(fù)3次，在不同時(shí)間點(diǎn)加入CCK8試劑，37℃靜置2 h后用酶標(biāo)儀檢測樣品的D450nm值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 敲低CXCR4基因慢病毒的構(gòu)建、鑒定

我們在設(shè)計(jì)CXCR4引物序列時(shí)引入一個(gè)PstⅠ酶切位點(diǎn)，而載體pLKO.1上沒有該酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后，如果能獲得長度約為6.3 kb和700 bp的2條帶，則表明干擾CXCR4的基因序列已插入載體pLKO.1。選酶切鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳（圖1）和DNA測序結(jié)果（未示）表明CXCR4 shR?NA慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.2 Western印跡檢測慢病毒感染后HGC27細(xì)胞中CXCR4蛋白水平

用敲低 CXCR4表達(dá)的慢病毒顆粒感染HGC27細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞系。經(jīng)Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白表達(dá)水平被顯著抑制，說明CXCR4 shRNA慢病毒載體有效干擾了HGC27細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)（圖2）。

2.3 生長曲線檢測抑制CXCR4表達(dá)對HGC27細(xì)胞增殖的影響

為了研究CXCR4對HGC27細(xì)胞增殖的影響，用CCK8試劑盒檢測敲低CXCR4表達(dá)后的HGC27細(xì)胞生長，結(jié)果見圖3，敲低CXCR4表達(dá)的HGC27細(xì)胞生長速度明顯慢于對照組，表明CXCR4在HGC27腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 表達(dá)載體的PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定

圖2 Western印跡檢測慢病毒感染后

圖3 敲低CXCR4表達(dá)抑制HGC27細(xì)胞增殖

3 討論

胃癌是最常見的腫瘤之一，其導(dǎo)致的死亡率居各類腫瘤的第三位。炎性趨化因子是一類具有70～80個(gè)氨基酸殘基的小分子蛋白，參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡及血管發(fā)生等生物學(xué)行為[8-9]。CXCR4廣泛表達(dá)于人體多種組織與細(xì)胞中，自2001年Muller[10]首次報(bào)道CXCR4在乳腺癌中高表達(dá)以來，不斷有學(xué)者報(bào)道其在多種腫瘤中呈過表達(dá)趨勢，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為高度相關(guān)[7]。SDF-1/CXCR4軸在人體中發(fā)揮多種重要的生物學(xué)功效，近年來很多學(xué)者對SDF-1/CXCR4軸在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行深入研究，以期為從SDF-1/CXCR4軸尋找可行的靶點(diǎn)治療提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4軸可調(diào)控多條信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、凋亡異常，并且導(dǎo)致腫瘤血管發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤生長[11-12]。在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移過程中，SDF-1/CXCR4軸主要通過誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶和VEGF-C上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移與擴(kuò)散[13]。同時(shí)，SDF-1/CXCR4軸通過激活PI3K-AKT信號通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[14]。我們通過構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒并感染HGC27細(xì)胞，之后進(jìn)行Western印跡檢測目的蛋白的表達(dá)及細(xì)胞生長試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在HGC27細(xì)胞中敲低CXCR4的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖。未來對于SDF-1/CX?CR4軸在胃癌中的作用機(jī)制，我們需要進(jìn)行更加系統(tǒng)、整體的研究，從而為SDF-1/CXCR4軸作為胃癌治療新靶點(diǎn)的可行性提供理論依據(jù)。

[1]Parkin D M,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancerstatistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55:74-108.

[2]Ferlay J,Shin H R,Bray F,et al.Estimates of world?wide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer,2010,127:2893-2917.

[3]Duan H,Chen L,Qu L,et al.Myeoplasm a hyorhinis infection promotes NF-κB-dependent migration of gas?tric cancer[J].Cancer Res,2014,74(20):5782-5794.

[4]Kollmar O,Rupertus K,Scheuer C,et al.CXCR4 and CXCR7 regulate angiogenesis and CT26.WT tu?mor growth independent from SDF-1[J].Int J Cancer, 2010,126(6):1302-1315.

[5]Nagasawa T,Kikutani H,Kishimoto T.Molecular clon?ing and structure of a pre-B-cell growth-stimulating factor[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(6):2305-2309.

[6]Zlotnik A,Burkhardt A M,Homey B.Homeostatic che?mokine receptors and organ-specific metastasis[J].Nat Rev Immunol,2011,11:597-606.

[7]Min J K,Koo B K,Erglis A,et al.Usefulness of non?invasive fractional flow reserve computed from coro?nary computed tomographic angiograms for intermedi?ate stenoses confirmed by quantitative coronary angiog?raphy[J].Am J Cardiol,2012,110(7):971-976.

[8]Zlotnik A,Yoshie O.Chemokines:a new classification system and their role in immunity[J].Immunity,2000, 12(2):121-127.

[9]Furuse K,Fukuoka M,Kawahara M,et al.Phase III study of concurrent versus sequential thoracic radio?therapy in combination with mitomycin,vindesine,and cisplatin in unresectable stage III non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,1999,17:2692-2699.

[10]Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Na?ture,2001,410:50-56.

[11]Mukaida N,Baba T.Chemokines in tumor develop?ment and progression[J].Exp Cell Res,2012,318:95-102.

[12]Ono S J,Nakamura T,Miyazaki D,et al.Chemo?kines:roles in leukocyte development,trafficking,and effector function[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111: 1185-1199.

[13]Hassan S,Buchanan M,Jahan K,et al.CXCR4 pep?tide antagonist inhibits primary breast tumor growth, metastasis and enhances the efficacy of anti-VEGF treatment or docetaxel in a transgenic mouse model[J]. Int J Cancer,2011,129:225-232.

[14]Ghosh M C,Makena P S,Gorantla V,et al.CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloprotein?ase-2[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2012, 302:L846-856.

CXCR4 Knockdown Inhibits Proliferation of Gastric Can?cer HGC27 Cells

LYU Xiao-Ye1,WANG Jian2,LI Xin-Yu3,PU Wen-Yuan4,HUANG Fang2, WANG Peng2,ZHOU Jian-Guang2,LI Shan-Hu2*,WEI Bo1*
1.General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3. School of Biomedical Engineering,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000;4.College of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228;China

Objective:To investigate the relationship between CXCR4 and tumor cell proliferation in gastric car?cinoma cells HGC27.Methods:After exogenous fragment was inserted into the pLKO.1 vector,the plasmid carry?ing CXCR4 shRNA was transfected into 293T cells.The supernatant containing lentiviral particles was used to in?fect HGC27 cells.Expression of CXCR4 was examined by Western blotting.The proliferation of tumor cells was examined by CCK8.Results:Double enzyme digestion and gene sequencing verified the correct constructed plas?mid.The lentiviral plasmid can inhibit the CXCR4 protein level of HGC27 cells.In addition,knockdown expres?sion of CXCR4 had the effects of inhibiting cell proliferation in HGC27 cells.Conclusion:The cell proliferation is repressed after CXCR4 was inhibited in HGC27 cells,which suggests that CXCR4 may be a potential therapeu?tic target in gastric cancer.

CXCR4;stromal cell-derived factor 1;gastric cancer;HGC27 cells

Q25;Q78

A

1009-0002（2017）02-0114-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.009

2017-01-12

國家自然科學(xué)基金（81372140，81372770，81470138）

呂曉業(yè)（1987-），男，碩士研究生；王?。?971-），男，博士；兩者為共同第一作者

衛(wèi)勃，（E-mail）weibo@vip.163.com；李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com

Co-corresponding authors,WEI Bo,E-mail:weibo@vip.163.com;LI Shan-Hu,E-mail:lishanhu6@163.com