侯月娥，伍建敏，李中圣

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400）

·研究論文·

PEDV和TGEV雙重TaqMan熒光定量一步法RT-PCR檢測方法的建立及應用

侯月娥，伍建敏，李中圣

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400）

本文通過對豬腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）基因組生物信息學分析，分別在兩種病毒基因保守區(qū)設計特異性探針和Real-Time PCR引物，并建立了檢測PEDV和TGEV的雙重實時熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，本研究建立的方法對其他常見病毒無交叉檢出，具有較強的特異性；應用本方法對PEDV和TGEV檢測靈敏度均可達101個拷貝。應用本法組裝PEDV和TGEV雙重實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒批次內(nèi)、批次間的變異系數(shù)CV（coefficient of variation，CV）分別低于0.58%和3.7%。應用該試劑盒對97份病例進行檢測，陽性率提高了14.93%。本研究建立的一步法熒光定量RT-PCR方法具有快速、特異性好、靈敏度高、定量且重復性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在PEDV和TGEV感染的快速鑒別診斷，以及流行病學調(diào)查方面都有廣闊的應用前景。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, P E D）和豬傳染性胃腸炎（t r a n s m i s s i b l e gastroenteritis, TGE）二者均為高度接觸性腸道疾病，主要發(fā)生在冬季和春季等寒冷季節(jié)，主要引起豬的嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水，各年齡段的豬均易感染。其病原分別是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV），這兩種病毒均可以破壞小腸上皮細胞而引起腸絨毛萎縮[1]，對哺乳仔豬的致死率分別為30%～80%、80%～100%[2-5]。由于二者引起的臨床癥狀、病理變化和流行病學極為相似，且往往混合感染，單憑臨床癥狀和組織病理學難以鑒別診斷[5]，近幾年已成為當前常見引起豬嚴重腹瀉的病毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PEDV和TGEV兩種病毒的分離、免疫組織化學和電鏡等常規(guī)的診斷技術操作繁瑣，耗時長且成本較高。隨著分子生物學的發(fā)展，PCR檢測方法，應用越來越廣泛[6-11]。實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR）以及后續(xù)的TaqMan熒光探針技術，是近年來發(fā)展起來的新一代檢測方法。將PCR與熒光檢測方法結(jié)合，不僅特異性更強，靈敏度更高，需求的樣品量更少，而且還能準確測定樣品中的病毒拷貝數(shù)，在病原診斷及病理分析方面有更為廣闊的應用前景。目前，國內(nèi)學者也建立了PEDV和TGEV的實時熒光定量PCR檢測方法[12-14]，但尚未見一步法雙重實時熒光定量RT-PCR技術同時檢測PEDV和TGEV的報道。本研究利用TaqMan探針上不同熒光基團可以檢測不同病毒的特點，將傳統(tǒng)的RT-PCR擴增兩步法合為一步，建立了能在一個反應體系中同時快速檢測PEDV和TGEV的TaqMan雙重熒光一步法RT-PCR檢測方法。該方法不僅大大縮短了檢測時間，而且也減少了檢測時的操作步驟，為快速準確的掌握這兩種病毒實際感染情況及預防控制提供了更加可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及質(zhì)粒 PEDV、豬瘟病毒（Classical swine faver virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus，PCV2）、TGEV、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductine and respiratory synarome virus，PRRSV）均由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院保存；大腸桿菌DH5α和pMD18TM-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑及主要儀器 體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購自Axygen公司；Ribonuclease Inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、αNTP均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自Omega公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（In vitro Transcription T7 Kit）購自TaKaRa公司；Bio-rad C1000 熒光定量PCR擴增儀；核酸蛋白檢測儀（Thermo）。

1.3 引物和探針的設計及合成 通過對PDEV和TGEV所有已知序列利用MegAlign進行同源性分析，確定其保守序列，然后根據(jù)PEDV（Genbank登錄號: KJ645708）和TGEV（Genbank登錄號:AF209745）的保守核酸序列，利用Beacon Designer 7設計軟件，設計特異性引物和熒光探針（表1），其中標準品引物設計時在5' 端引入了T7啟動子序列（加粗部分），擴增的雙鏈DNA片段可以在T7 RNA聚合酶作用下經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA，純化后用作標準品RNA。引物探針由上海Invitrogen公司合成。

1.4 PEDV和TGEV總核酸提取 參照體液病毒DNA/ RNA小量制備試劑盒說明書提取PEDV和TGEV所感染細胞的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PEDV和TGEV標準品制備 取1.4中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。應用PEDV引物PEDVT7-F/PEDV-T7-R和TGEV引物TGEV-T7-F/TGEVT7-R（見表1），以上述反轉(zhuǎn)錄的PEDV和TGEV基因組cDNA為模板，分別進行PEDV和TGEV目的基因擴增。擴增條件:94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應結(jié)束后，取5 μL PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增出PEDV（166 bp）和TGEV（191bp）目的基因。將獲得的兩者PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，分別克隆至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆重組質(zhì)粒，送Invitrogen公司測序鑒定。對于鑒定正確的重組質(zhì)粒，分別命名為pMD-PEDVT7和pMD-TGEVT7[15]。按照大連寶生物公司生產(chǎn)的T7反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，分別以純化后的兩種質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄。獲得體外轉(zhuǎn)錄RNA，將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA提取試劑盒純化后，進行濃度測定、拷貝數(shù)計算，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TaqMan熒光定量一步法RT-PCR擴增 以提取的PEDV和TGEV的核酸RNA為模板，反應體系如下: M-MLV Buffer 2 μL、M-MLV 0.25 μL、Ex TaqTMHS 0.3 μL、2.5×dNTP 1.5μL，將引物PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R和探針稀釋至終濃度為0.1～0.6 μmol/mL，模板RNA為1.5 μL，無RNase的水補足反應體系為10 μL。TaqMan實時熒光定量一步法RT-PCR擴增程序:37℃孵育5 min，95℃預變性1 min，然后95℃變性10 s，退火溫度55℃～65℃30 s，40個循環(huán)。按照不同體系，不同濃度配比，不同的退火溫度進行一步法實時熒光定量RT-PCR反應條件優(yōu)化，篩選出最好的體系、引物、探針濃度及退火溫度。

1.7 TaqMan熒光定量RT-PCR標準曲線的建立 將1.5制備的PEDV和TGEV的RNA標準品做10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的RNA作為模板，每個梯度的RNA設立3個重復。使用摸索出來的反應體系進行實時熒光定量RT-PCR擴增。熒光定量RT-PCR的反應條件:37℃孵育5 min，95℃預變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)1.6摸索出來的最適溫度，40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時進行熒光信號采集。

1.8 雙重TaqMan熒光定量RT-PCR敏感性、特異性和穩(wěn)定性試驗

1.8.1 敏感性試驗 將測定好RNA濃度的模板進行10倍系列稀釋，用已建立的雙重TaqMan熒光定量RTPCR測定其敏感性。

1.8.2 特異性試驗 分別以提取的PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV核酸RNA以及PCV2、PRV的DNA為模板，分別進行RT-PCR/PCR擴增，驗證其特異性。

1.8.3 穩(wěn)定性試驗 在上述已經(jīng)稀釋好的樣品中選取1×106copies/μL～1×101copies/μL，進行3次重復性試驗，每個梯度濃度均做3個重復，然后比較批次內(nèi)和批次間的變異系數(shù)。

1.9 臨床樣本的檢測試驗 選取經(jīng)過普通PCR檢測驗證的PEDV和TGEV共同陽性、單獨PEDV陽性或TGEV陽性，PEDV和TGEV可疑的樣品分別為13份和8份，另外其他病毒也陽性的部分樣品，其中動物組織31份、血清26份、感染不同代次的細胞19份，共累計樣本97份。分別采用該雙重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法進行樣品陰陽性鑒定，從而驗證該方法的靈敏性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 RNA標準品的制備 應用含有T7啟動子序列的PEDV-T7-F/PEDV-T7-R、TGEV-T7-F/TGEVT7-R的引物分別進行相應病毒的PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測。將切膠純化的PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-PEDVT7和pMD-TGEVT7，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，將陽性的重組質(zhì)粒測序鑒定。結(jié)果顯示，兩對引物均能擴增出相應的目的片段（圖1）。

圖1 PEDV和TGEV陽性重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.1 Identifi cation results of PEDV and TGEV positive recombinant plasmidsM∶ DNA分子量標準(DL2000); 1∶ TGEV基因的PCR產(chǎn)物; 2∶PEDV基因的PCR產(chǎn)物M∶ DNA Marker(DL2000); 1∶ PCR products of TGEV; 2∶ PCR products of PEDV

2.2 雙重TaqMan熒光定量PCR擴增 通過對PEDV和TGEV單項和雙重實時熒光定量RT-PCR的條件優(yōu)化，PEDV-F/PEDV-R的終濃度為0.35 μmol/mL，探針終濃度為0.3 μmol/mL，TGEV-F/TGEV-R的終濃度為0.3 μmol/mL，探針終濃度為0.2 μmol/mL，退火溫度為60℃時，對同一標準品的檢測信號值最強，Ct值最小。

2.3 雙重TaqMan熒光定量PCR標準曲線的建立 PEDV和TGEV的熒光定量PCR反應標準品，其RNA混合液的梯度濃度從1×106copies/μL～1×101copies/μL的6個線性梯度的檢測標準曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性（圖2）。

2.4 雙重TaqMan熒光定量PCR特異性、敏感性以及穩(wěn)定性

2.4.1 特異性試驗 以PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV的基因組為模板進行TaqMan熒光定量RT-PCR擴增，結(jié)果顯示，僅有PEDV、TGEV二者相應病毒的熒光信號為陽性，其他病毒的檢測均為陰性，說明此次構(gòu)建的雙重TaqMan熒光定量RT-PCR方法的特異性較強（圖3）。

圖2 PEDV(A)和TGEV(B)的Real-time RT-PCR標準曲線Fig.2 Real-time RT-PCR standard curve for PEDV(A) and TGEV(B)

圖3 雙重熒光RT-PCR體系的特異性檢測Fig.3 Specifi city test of the Real-time RT-PCR system for PEDV和TGEV detection

2.4.2 敏感性試驗 將體外轉(zhuǎn)錄純化后的PEDV和TGEV的RNA標準品，用核酸蛋白檢測儀測定其濃度，計算其拷貝數(shù)，然后進行10倍系列梯度稀釋，獲得1×106copies/μL～1×101copies/μL，利用本研究建立的一步法PEDV和TGEV雙重實時熒光定量進行擴增，得到PEDV和TGEV TaqMan探針法實時熒光定量RT-PCR的動力學擴增曲線（圖4），在Ct＜40范圍內(nèi)可以檢出的最低RNA量為10 copies/μL，因此建立的此方法敏感性可以達到10 copies/μL。與本實驗室前期構(gòu)建的檢測PEDV和TGEV普通PCR及SYBR Green Real-time PCR法相比較，是普通PCR法敏感性的100倍（圖5），SYBR Green Real-time PCR敏感性的10倍，并且檢測結(jié)果較SYBR Green Real-time PCR法方法穩(wěn)定。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 熒光定量RT-PCR反應標準品的梯度濃度從1×106copies/μL～1×101copies/μL的6個濃度，通過每一個濃度樣本的3次重復性試驗測定的Ct值來檢驗該方法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，同批內(nèi)的變異系數(shù)分別為0.05%、0.58%、0.16%、0.09%、0.41%、0.32%；批間的變異系數(shù)分別為1.8%、2.7%、3.3%、2.4%、3.2%、3.7%（表2）。將混合好的標準品存放于-80℃，1個月后重復檢測結(jié)果依然可信，驗證了該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

圖4 熒光定量RT-PCR體系的敏感性檢測Fig.4 Sensitivity of the Real-time RT-PCR for PEDV and TGEV detection注∶ PEDV (a至f) 和 TGEV (1至6)模板拷貝數(shù)依次∶ 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×10Note∶ PEDV (a to f) and TGEV (1 to 6), and the number of copies were 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102and 1×10 copies，respectively

表2 PEDV和TGEV雙重熒光定量PCR重復性試驗Table 2 Repetitive and stability verifi cation of PEDV and TGEV duplex fl uorescence quantitative PCR

圖5 普通RT-PCR PEDV和TGEV標準品敏感性檢測Fig.5 Sensitivity test of the normal PCR for PEDV and TGEV注∶ PEDV(1至7)和TGEV(8至13)拷貝數(shù)依次為∶ 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10; 14∶ 陰性對照; M∶ DNA分子量標準(DL2000)Note∶ PEDV(1 to 7) and TGEV(8 to 14), and the number of copies were 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102, 1×10 copies, respectively; 14∶ Negative; M∶ DNA Marker(DL2000 )

2.5 臨床樣本檢測結(jié)果 對76份普通PCR鑒定的已知臨床病料和21份可疑臨床病料進行檢測結(jié)果顯示，PEDV和TGEV共同陽性7份，病毒拷貝數(shù)在3.1×103～9.7×107copies/μL（超過以及等于106copies/μL的樣品，均102倍稀釋后再次檢測），感染率為7.2%；單PEDV陽性的47份，病毒拷貝數(shù)為1.3×101～9.1×109copies/μL，感染率為48.45%；單TGEV陽性13份，病毒拷貝數(shù)為1.5×101～7.5×107copies/μL，感染率為13.4%；21份可疑的病料檢測結(jié)果顯示，感染PEDV的7份，感染TGEV的3份，其他樣品為陰性，與已知樣品結(jié)果的符合率為114.93%。

3 討論

PEDV和TGEV作為豬病毒性腹瀉的主要病原，近年來引起的豬病毒性腹瀉在國內(nèi)外的各大豬場反復爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前常規(guī)的病毒診斷方法有病毒分離、熒光抗體檢測、血清學診斷方法和免疫組織化學以及PCR方法等，由于病毒分離困難，PCR方法具有快速、特異、準確等優(yōu)點，現(xiàn)己經(jīng)廣泛應用于畜禽傳染病的快速診斷。上述診斷方法在特異性上尚存在一定的缺陷，在敏感性方面對早期感染往往不能做出準確的判定。單一的RT-PCR方法用于多種病毒感染的臨床鑒別診斷時，不能一次達到目的，并且因為需要對不同檢測病毒分別進行擴增，樣品需求量較大，耗時較長。疾病的嚴重程度與病毒的含量相關，傳統(tǒng)的檢測方法很難準確測定樣品中的病毒含量，因此實時熒光定量RT-PCR方法不僅在定量研究中具有重要意義，而且在檢測病毒存在及其在疾病發(fā)展過程中病毒對機體持續(xù)性作用方面的也起重要作用[16]。

PEDV和TGEV多重實時熒光定量RT-PCR的文獻已有陸續(xù)的報道[17]，而一步法PEDV和TGEV雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法目前沒有報道。本研究建立方法存在顯著優(yōu)勢:不需要反轉(zhuǎn)錄，提取的RNA可以直接做為模板檢測，并能一次確診單一感染或混合感染，可以準確得知兩種病毒在疾病感染中拷貝數(shù)的變化情況，達到診斷、鑒別和定量的多重目的，比傳統(tǒng)檢測方法更準確便快捷。

本研究對PEDV和TGEV分別設計1條探針和與探針匹配的2對特異性引物，通過優(yōu)化單項試驗選取與探針匹配更好的一對特異性引物，然后再對多重實時熒光定量RT-PCR反應條件進行優(yōu)化。將提取的PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV核酸RNA以及PCV2、PRV的DNA模板進行實驗，僅有目的曲線擴增，其余均為陰性，說明具有良好的特異性。敏感性試驗的結(jié)果顯示可以檢出的最低RNA量可達到101copies/μL，R2＞99%，具有較好的標準曲線和線性關系。與常規(guī)的RT-PCR反應和已構(gòu)建的SYBR Green方法比較，是普通RT-PCR的100倍，已構(gòu)建的SYBR Green方法的10倍。穩(wěn)定性試驗的結(jié)果顯示批次內(nèi)的變異系數(shù)≤0.58%，批次間的變異系數(shù)均≤3.7%，說明該方法具有較好的重復性和穩(wěn)定性。本研究建立的雙重實時熒光定量RT-PCR方法只需要較少的樣品就可以對PEDV和TGEV進行準確的定性和定量檢測，彌補了傳統(tǒng)檢測方法在重復性和耗時長的不足，同時具有較高的特異性，可以避免臨床樣品中其他病原的干擾。臨床發(fā)病中PEDV和TGEV二者混合感染比例較高，且在腹瀉病例中占較高的比例，本研究所建立的方法適用于臨床PEDV和TGEV的快速檢測診斷及病理分析。

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DEVELOPMENT OF ONE STEP DUPLEX TAQMAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS AND TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS

HOU Yue-e, WU Jian-min, LI Zhong-sheng

(Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China)

In the present study, one step duplex TaqMan fl uorescent real-time RT-PCR assay of PEDV and TGEV was developed to detect and differentiate Porcine epidemic diarrhea virus, (PEDV) and Transmissible gastroenteritis virus, (TGEV). The specifi c primers and TaqMan fl uorescent probes of these viruses were designed based on the bio-information analysis and then the amplifi cation condition and the concentration of each virus were optimized. The result showed that the detection limits were 101copies for both PEDV and TGEV and there was no cross reaction with other common viruses. Subsequently, one step Duplex TaqMan Real-time PCR assay was assembled into the PEDV and TGEV Detection Kit. The inter and intra-assay trials demonstrated that the variations were less than 0.58% and 3.7%, respectively, indicating its good reproducibility. Total 97 samples were examined using this kit and the positive rate of PEDV and TGEV was 14.93% higher than the current PCR method. These results demonstrated that this assay was a rapid, specifi c and sensitive method for detection of PEDV and TGEV. In conclusion, the method established in the present study can be used for rapid detection and epidemiology study of PEDV and TGEV.

Porcine epidemic diarrhea virus; Transmissible gastroenteritis virus; duplex TaqMan real-time RT-PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0019-07

2016-05-03

廣東省科技計劃項目——豬偽狂犬突變株的鑒定及新型、高效豬偽狂犬疫苗開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化（2015B020203006）

侯月娥，女，碩士，主要從事畜禽和水產(chǎn)疫病及病疫防治技術方面的研究

李中圣，E-mail:Lizs@haid.com.cn