宰金麗，馬 帥，王 濤，賈秉光，柴淑梅，張 倩，林矯矯，傅志強

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

日本血吸蟲TOR真核表達載體的構建及其在293T細胞中的表達

宰金麗，馬 帥，王 濤，賈秉光，柴淑梅，張 倩，林矯矯，傅志強

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究擴增到日本血吸蟲SjTOR完整的蛋白編碼區(qū)并將其克隆到pXJ40-FLAG載體的Hind Ⅲ、XhoⅠ 酶切位點，構建真核表達質粒pXJ40-FLAG-TOR。將測序正確的質粒轉染到293T細胞中進行表達，然后應用間接免疫熒光、實時熒光定量PCR、Western blot檢測其在293T細胞中的表達情況。測序結果表明SjTOR蛋白編碼區(qū)為1245 bp，真核表達質粒pXJ40-FLAG-TOR構建成功。轉染293T細胞48 h后，應用間接免疫熒光染色可觀察到轉染重組質粒的細胞有特異性綠色熒光，空質粒對照則未見。實時熒光定量PCR結果顯示，在轉染質粒 pXJ40-FLAG-TOR 6 h后SjTOR蛋白的基因已有轉錄，至轉染24 h時轉錄水平最高，隨后開始降低。Western blot結果顯示SjTOR蛋白分子量約53 kDa，可被FLAG單抗和抗SjTOR-ED1抗血清識別。結果表明SjTOR蛋白可以在293 T細胞中表達，為進一步研究SjTOR蛋白的生物學功能和DNA疫苗打下了基礎。

日本血吸蟲；TOR蛋白；基因克隆；真核表達

日本血吸蟲病是我國南方地區(qū)嚴重危害人民身體健康和社會經濟發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，其病原體是日本血吸蟲。血吸蟲尾蚴鉆過終末宿主的皮膚，經歷復雜的移行過程發(fā)育為成蟲后，在哺乳動物的下腔靜脈系中長期寄生。血吸蟲是一種古老的寄生生物，在長期進化過程中形成了對宿主的適應性，特別是其通過各種途徑（分子）逃避宿主免疫損傷，避免被宿主的免疫應答所清除，這一現象稱免疫逃避，它是吸血蟲得以在宿主體內長期存活并完成生活史的關鍵[1]。補體反應是反應非常迅速、級聯放大的免疫防御機制，是機體免疫應答的重要組成部分。研究表明血吸蟲尾蚴突破皮膚屏障后就受到宿主免疫應答的攻擊，補體反應是宿主最早開始殺傷蟲體的免疫應答[2,3]。已有研究表明在成蟲階段，血吸蟲可通過和補體C1q結合最終抑制膜攻擊復合物形成來抑制和調節(jié)宿主補體反應[4,5]。已發(fā)現多個血吸蟲分子可能和補體免疫調節(jié)相關，并且作用于補體反應的多個節(jié)點[2]。

TOR（trispanning orphan receptor）蛋白是一種位于血吸蟲體被表面抗原受體，可以結合補體C2a分子[3]，推測其在血吸蟲免疫逃避過程中起重要作用。本實驗室馬帥等[6]克隆了日本血吸蟲TOR基因，利用原核系統表達了SjTOR基因N端第一個膜外區(qū)的重組蛋白，該重組蛋白具有較好的抗原性并能誘導顯著的減蟲率。日本血吸蟲TOR全長蛋白的研究尚未見報道。分析SjTOR基因的翻譯修飾位點時發(fā)現其具有較多的糖基化位點和磷酸化位點，這些可能對其生物學功能有重要作用。在大腸桿菌中獲得的重組蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。因此本研究利用分子生物學技術構建了真核表達質粒pXJ40-FLAG-TOR并在真核細胞293T細胞中表達SjTOR蛋白，為進一步在體內研究SjTOR全長蛋白的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 Trizol、SuperscriptTMⅢ反轉錄酶購自Invitrogen 公司；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T 載體、HindⅢ、XhoⅠ限制性內切酶、TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）均購自 TaKaRa 生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒、小型質?；厥赵噭┖匈徸?Axygen公司；大型質粒純化回收試劑盒購自 QIAGEN 公司；FuGene?HD 轉染試劑購自Progema 公司；Anti-FLAG mouse monoclonal antibody購自 CMCTAG 公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自北京碧云天生物技術研究所；pXJ40-FLAG 質粒由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所禽病實驗室保存；Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor? 488 conjugate購自Invitrogen; DAPI 染料購自上海前塵生物科技有限公司；抗熒光淬滅封片液購自sigma公司；293T細胞為本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、PBS購自Gibco公司；日本血吸蟲蟲體由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲實驗室保存；6 周齡雄性 BALB/c 購自上海斯萊克實驗動物有限公司；中國大陸株日本血吸蟲陽性釘螺由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。

1.2 方法

1.2.1 利用在線軟件預測SjTOR磷酸化和糖基化位點 分別利用DISPHOS預測蛋白磷酸修飾位點，YinOYang 1.2 和NetNGlyc 1.0 Server分別預測氨基酸O型糖基化修飾位點和 N型糖基化修飾位點。

1.2.2 載體構建與引物設計 設計引物分別在SjTOR基因ORF的上、下游引入Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切位點，PCR反應體系與條件參考2×Taq Master Mix（康為世紀）說明書。PCR反應條件:94℃預變性 2 min；94℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 90 s，共34個循環(huán)；72℃終延伸2min，4℃終止反應。PCR產物經小量DNA片段快速純化回收試劑盒純化回收后，與pXJ40-FLAG載體進行雙酶切連接，轉化至DH5α中，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定并進行測序驗證。將構建成功重組質粒pXJ40-FLAG-TOR利用QIAGEN 質粒抽提試劑盒大量提取質粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉染293T細胞 將生長狀態(tài)良好的細胞用完全培養(yǎng)基稀釋到一定的細胞濃度，分別加入孔板，待細胞匯合度達90%左右，按照FuGENE? HD Transfection Reagent試劑盒操作說明書進行轉染。

1.2.4 實時熒光定量分析293T細胞轉染pXJ40-FLAG-TOR基因后的轉錄水平 分別于轉染細胞前和轉染細胞后6、12、18、24、30、36、42、48 h收集293 T細胞，棄去培養(yǎng)基后用 PBS 洗2次，DEPC水洗1次，然后加入Trizol反復吹打細胞，提取細胞的總RNA并反轉錄成cDNA。以SjTOR的熒光定量 PCR引物和人 GAPDH 基因為內參，以各轉染時期的細胞cDNA 為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑說明書進行熒光定量 PCR 分析，每個實驗重復3次。GAPDH內參基因的引物信息見表1。

表1 GAPDH內參基因的引物Table 1 Primers for reference gene GAPDH

1.2.5 免疫熒光檢測（immunofluorescence assay，IFA）鑒定蛋白表達 293T細胞轉染48 h后，移去培養(yǎng)基，用1×PBS清洗細胞2次，動作要輕柔。固定、透化細胞后，用3%BSA室溫封閉2 h，加入1∶100稀釋的ED1血清，4℃孵育過夜，吸去一抗，用1×PBST清洗細胞3次。避光加入1∶2000稀釋的Goat anti-Mouse IgG (H+L) 二抗, Alexa Fluor? 488 conjugate，室溫避光孵育1h；吸去二抗，用1×PBST清洗細胞3次，動作要輕柔，加入細胞核染色液DAPI避光作用5 min；用1×PBST清洗細胞3次后用Sigma抗熒光淬滅封片液封片。用倒置熒光顯微鏡觀察熒光情況，拍照保存。

1.2.6 Western blot檢測目的蛋白在不同時間的表達情況 分別收取未轉染細胞，以及轉染后9、12、15 h的細胞，加入強裂解液4℃裂解，離心取細胞裂解液上清進行Western blot，分析SjTOR在293T細胞中的表達。

2 結果

2.1 在線軟件預測氨基酸磷酸化和糖基化修飾位點

利用DISPHOS預測SjTOR蛋白中氨基酸的磷酸化修飾位點，結果可能存在8個絲氨酸修飾位點分別是126、127、132、138、140、142、146、155位絲氨酸，4個蘇氨酸修飾位點分別是148、318、326、405位蘇氨酸，3個酪氨酸修飾位點分別是129、327、336位酪氨酸。其中10個修飾位點位于SjTOR的第一個膜外區(qū)和C末端。應用YinOYang預測氨基酸O型糖基化修飾位點，結果在138S、376T、379S、405T、407T等5個氨基酸可能存在O型糖基化修飾，分別位于SjTOR的第一個膜外區(qū)和C末端。應用NetNGlyc 1.0 Server預測N型糖基化修飾位點，結果在305NLTG、314NESN、362NLTQ、372NTTS、377NVST、389NTTT、 393NVTS等7個基序區(qū)可能存在N型糖基化修飾。分析結果如圖1。

圖1 SjTOR氨基酸磷酸化和糖基化位點分析Fig. 1 Analysis of amino acid phosphorylation and glycosylation sites of SjTOR

2.2 成功構建pXJ40-FLAG-TOR 以構建的真核表達質粒pXJ40-FLAG-TOR為模板進行雙酶切鑒定，酶切片段大小與插入片段大小一致（圖2），序列分析結果表明插入片段位點方向正確，pXJ40-FLAGTOR真核表達質粒構建成功。

2.3 293T細胞轉染后的SjTOR基因轉錄水平 pXJ40-FLAG-TOR質粒轉染293T細胞后，分別于轉染細胞前和轉染細胞后6、12、18、24、30、36、42、48 h收集293T，應用實時熒光定量PCR 分析SjTOR基因在細胞中的轉錄水平。結果顯示，在轉染后6 h該基因已有轉錄，24 h轉錄水平達最高，隨后開始降低，符合瞬時轉染基因轉錄的特征（圖3）。

圖2 重組質粒PXJ40-FLAG-TOR酶切鑒定Fig.2 Identifi cation of the recombinant plasmid pXJ40-FLAG-TOR digested by Hind Ⅲ and Xho ⅠM∶ DNA分子量標準(DL5000); 1∶ pXJ40-FLAG-TORM∶ DNA Marker(DL5000); 1∶ pXJ40-FLAG-TOR

圖3 SjTOR在293T細胞中不同時間的轉錄水平Fig. 3 Transcription level of SjTOR in 293T cells at different times

2.4 IFA檢測293T細胞的表達 在轉染48 h后細胞經免疫熒光染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，轉染pXJ40-FLAG-TOR質粒的293T細胞內可見綠色熒光，主要分布于胞質和細胞膜部分，陽性細胞占比大約為27%，而轉染空質粒pXJ40-FLAG的293T細胞未見綠色熒光（圖4）。

圖4 TOR在293T細胞中表達的免疫熒光檢測結果Fig.4 IFA result of TOR expressed in 293T cells A∶ pXJ40-FLAG-TOR轉染293T細胞48 h; B∶ pXJ40-FLAG轉染293T細胞48 h

2.5 Western blot檢測TOR蛋白在293T細胞中的表達 分別收取未轉染質粒的細胞和轉染質粒后9、12、15 h的293T細胞，制備細胞蛋白裂解液，分別應用FLAG單抗、抗SjTOR-ED1血清、小鼠正常血清和抗GAPDH單抗進行進行 Western blot 檢測，結果FLAG單抗和抗SjTOR-ED1血清均能識別特異性條帶，分子量大約在53 kDa，小鼠正常血清未識別任何條帶，GAPDH單抗識別的蛋白條帶大約在36 kDa，和GAPDH的理論分子量一致。結果表明，在轉染9 h時可見有微量SjTOR蛋白表達，在轉染15 h時表達量較高（圖5）。

圖5 Western blot檢測TOR蛋白的表達情況Fig.5 Western blot analysis of TOR protein expression in 293T cellsA∶一抗為小鼠FLAG單抗; B∶一抗為小鼠SjTOR-ED1三免血清; C∶ 一抗為小鼠陰性血清; D∶ 一抗為GAPDH單抗. M∶ 蛋白分子量標準A∶ Anti-FLAG mouse monoclonal antibody ; B∶ Probed by positive mouse serum; C∶ Probed by normal mouse serum; D∶ Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody. M∶ Protein molecular weight Marker

3 討論

血吸蟲病嚴重危害著人畜健康，被認為是僅次于瘧疾的全球第二大寄生蟲疾病[7]。吡喹酮藥物在我國血吸蟲病的防控中起到重要作用，但是實踐表明，由于血吸蟲中間宿主釘螺難以消滅，家畜傳染源未能得到有效控制，單獨以大規(guī)模吡喹酮治療為主的防治措施難以阻斷血吸蟲病的傳播，且難以解決預防和重復感染的難題。因此，加強血吸蟲病疫苗的研制與開發(fā)，將藥物治療的短效作用與疫苗的長效預防作用相結合，是血吸蟲病防治的重要發(fā)展方向[8]。

Inal等[9]首先在埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲中鑒定到TOR。隨后研究人員發(fā)現TOR廣泛存在于包括早期的硬骨鱈魚以及大鼠和人類等多種生物中[10]。埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲TOR的研究結果表明該分子是一個有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原分子[9]。研究表明TOR可能通過結合補體C2分子從而干擾補體經典途徑的激活[11-15]或者通過阻斷D因子介導的B因子的裂解從而干擾補體替代途徑的激活[16]。

馬帥等[6]研究結果表明日本血吸蟲TOR蛋白沒有信號肽，有4個跨膜區(qū)，SjTOR的ed1是其功能的主要載體。以日本血吸蟲TOR分子的第一個膜外區(qū)段制備的重組蛋白在小鼠中誘導了較高的免疫保護效果。本研究分析表明TOR具有多個潛在的磷酸化和糖基化位點，且多數位于第一個膜外區(qū)。重組蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式表達，在純化過程中復性，由于重組蛋白中的凝血酶因素和重折疊過程中的不確定性有可能使其生物學功能受影響, 如能成功應用真核系統表達則可以收獲經過正確的體內折疊的活性蛋白，對其生物學功能研究有較大的促進[17]。本研究成功構建了SjTOR的真核表達質粒pXJ40-FLAG-TOR，轉染293T細胞后經檢測顯示該質粒可以在293T細胞中表達，該研究結果為TOR功能研究奠定了堅實基礎。進而可以制備吸血蟲DNA疫苗，在動物體內評價SjTOR作為候選疫苗分子的潛力。

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CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION VECTOR OF
SCHISTOSOMA JAPONICUM TOR AND ITS EXPRESSION IN 293T CELLS

ZAI Jin-li, MA Shuai, WANG Tao, JIA Bing-guang, CHAI Shu-mei, ZHANG Qian, LIN Jiao-jiao, FU Zhi-qiang

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The DNA fragment encoding Schistosoma japonicum TOR protein were amplifi ed from cDNA templates by PCR and cloned into pXJ40-FLAG through HindⅢ、XhoⅠto construct the eukaryotic expression plasmid pXJ40-FLAG-TOR. The recombinant plasmid was verifi ed by sequencing and transfected into 293T cells. The expression of the target protein in 293T cell was detected by indirect immunofl uorescence, Western blot and quantitative Real-time PCR. Successful expression of SjTOR protein was confi rmed by the specifi c green fl uorescence in 293T cells after transfection for 48 h and no green fl uorescence in the cell transfected with the control plasmid. Quantitative Real-time PCR results showed that the transcription of SjTOR gene in 293T cells could be detected at 6 h and came to a head at 24 h after trandfection, since then began to decline. Western blot results demonstrated that SjTOR with the molecular weight of 53 kDa was recognized by Anti-FLAG mouse monoclonal antibody and SjTOR-ED1 antiserum. Results showed that the SjTOR proteins could be expressed in 293 T cells, and laid a foundation for further research on SjTOR biological function and its DNA vaccine.

Schistosoma japonicum; TOR protein; gene clone; eukaryotic expression

S852.735

A

1674-6422（2017）01-0066-06

2016-08-16

國家自然科學基金（31472188）；國家科技支撐計劃（2015BAI09B04）；上海市領軍人才后備隊計劃（201442）

宰金麗，女，碩士研究生，獸醫(yī)學專業(yè)

傅志強，E-mail:fuzhiqiang@shvri.ac.cn