李丹丹，馬麗貞，苑純秀，史曉娜，艾 敏，塔 娜，馮新港

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重開放點實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

·研究論文·

日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化鼠巨噬細胞的初步研究

李丹丹1,2，馬麗貞1，苑純秀1，史曉娜1,2，艾 敏1，塔 娜1，馮新港1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重開放點實驗室，上海200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

為研究日本血吸蟲高遷移率族蛋白（Schistosoma japonicum high mobility group box1, Sj HMGB1）體外活化小鼠巨噬細胞的功能，利用真核重組Sj HMGB1蛋白與巨噬細胞共培養(yǎng)48 h，流式細胞術檢測巨噬細胞表面標志分子以及趨化因子受體的表達。收集Sj HMGB1蛋白與巨噬細胞共孵育48 h后上清，ELISA檢測上清中TNF-α與 IL-10的含量，Griess法檢測上清中NO的含量。流式結果顯示，與對照組相比，Sj HMGB1蛋白刺激組的巨噬細胞表面MHC-Ⅱ分子，TLR4受體以及趨化因子受體CCR7的表達顯著上調且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TLR2受體的表達顯著下調，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ELISA結果顯示，Sj HMGB1能夠刺激巨噬細胞分泌致炎因子TNF-α，未能促進抑炎因子IL-10的釋放。Griess法表明Sj HMGB1能夠促進巨噬細胞分泌NO。本研究結果表明Sj HMGB1可能通過TLR4通路活化小鼠巨噬細胞并誘導其向致炎性M1型巨噬細胞極化。

日本血吸蟲；高遷移率族蛋白；巨噬細胞；TLR；細胞因子

血吸蟲病是一種人畜共患的慢性消耗性寄生蟲病[1]。隨著吸血蟲耐藥性等問題的出現(xiàn)，研制出高效、實用的抗血吸蟲疫苗迫在眉睫。研究表明，輻照血吸蟲疫苗能夠誘導高保護性免疫效果，其機制可能是通過輻照血吸蟲來源的分子刺激宿主免疫細胞在肺部形成了以Th1為主要應答的致炎性環(huán)境而實現(xiàn)[2]，近年來，探索輻照致弱血吸蟲尾蚴或童蟲疫苗（RAV）的高保護性效應機制，已成為學者們關注的熱點課題，其中RAV的免疫原性分子與細胞基礎及機制等問題尤其受到重視[3]。通過研究RAV免疫誘導的高保護性效應機制，推測在輻照致弱血吸蟲疫苗模型中可能存在一類蟲源性應急分子，如日本血吸蟲高遷移率族蛋白（SjHMGB1)、熱休克蛋白70（SjHSP70）以及鈣網織蛋白（SjCRT)等發(fā)揮著重要作用。這些研究結果為研制安全有效的血吸蟲分子疫苗提供了指導。HMGB1作為內源性的DAMPs的典型代表，是介導先天性免疫的一個關鍵分子，在組織損傷、炎癥反應、干細胞的募集和活化以及組織修復過程中均發(fā)揮作用[4]。王利利等[5,6]研究表明電離輻射可以誘導HMGB1分子通過乙?；饔脧暮藘戎涟麧{再到胞外的移位。Gnanasekar等[7]發(fā)現(xiàn)，SmHMGB1可以誘導小鼠巨噬細胞產生TNF-α、IL-6、IL-13等細胞因子，故SmHMGB1在曼氏血吸蟲中可能是血吸蟲宿主體內炎癥免疫反應過程中的一個關鍵分子。據(jù)此，我們推測SjHMGB1作為一類蟲源性的應急分子，在RAV模型誘導的高保護性免疫效應中，通過與宿主免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞等的相互作用，形成了驅動固有免疫和適應性免疫應答的環(huán)境，從而發(fā)揮免疫保護作用。相關的研究還顯示，巨噬細胞在介導殺滅肺期童蟲和形成肺部炎性反應環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。胞外HMGB1可能與細胞表面的相關受體，例如晚期糖基化受體，TLR2、TLR4以及其他未知受體結合從而激活相應的免疫細胞[9,10]。因此，本研究以小鼠RAW264.7巨噬細胞系作為模型，在SjHMGB1刺激后，檢測巨噬細胞細胞因子以及細胞表面標志分子與受體的分泌表達情況，為進一步闡明SjHMGB1在 RAV中所發(fā)揮的功能提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基與胰酶購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司；PE標記的抗TLR4單抗和FITC標記的抗TLR2單抗購自eBioscience公司；FITC標記的抗MHC-Ⅱ單抗購自BD公司；PE標記的抗CCR7單抗購自BD公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit以及Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go Kit購自eBioscience公司；NO檢測試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；其他試劑為進口或國產分析純。

1.1.2 蛋白和細胞株 SjHMGB1蛋白為桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)所表達，由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室構建保存；小鼠RAW264.7巨噬細胞株為中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞的培養(yǎng) RAW264.7巨噬細胞復蘇后，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中定期傳代培養(yǎng)，采用處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2 SjHMGB1蛋白刺激巨噬細胞 通過胰酶消化巨噬細胞，收集離心，用完全培養(yǎng)基重懸，調整巨噬細胞的濃度為1×106個/mL，加入48孔細胞培養(yǎng)板中（1 mL/孔）。實驗組加入真核蛋白SjHMGB1，濃度為 50μg/mL，同時設陰性對照組（未刺激）和LPS（50μg/mL）陽性對照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 流式細胞術檢測巨噬細胞表面分子及受體的表達 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細胞48 h后，收集各組細胞。4℃、239×g離心5 min，細胞沉淀用200 μL RPMI1640懸起，每管加入2μL Rat Anti-Mouse CD16/CD32 抗體，4℃封閉30 min，以消除抗體非特異性結合。用含3%熱滅活的胎牛血清及0.1%疊氮鈉的PBS緩沖液洗2次，分別加入PE標記的Rat Anti-Mouse TLR4抗體、FITC標記的Rat Anti-Mouse TLR2抗體、FITC標記的Rat Anti-Mouse MHC-Ⅱ抗體、PE標記的Rat Anti-Mouse CCR7抗體，4℃避光孵育30 min，4℃、239×g離心5 min，用預冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS重懸轉至流式管中，流式儀檢測。

1.2.4 ELISA檢測SjHMGB1刺激巨噬細胞后TNF-α和IL-10的分泌情況 采用上述方法處理巨噬細胞并收集培養(yǎng)細胞的上清，按細胞因子待檢試劑盒說明書要求稀釋各溶液。將稀釋后的capture antibody加入96孔酶標板中（100 μL/孔），4℃包被過夜；0.05%PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室溫封閉1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL 樣品或標準品，室溫孵育2 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL detection antibody，室溫孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL酶標二抗，室溫避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL substrate solution，室溫避光孵育15 min；每孔加入50 μL stop solution終止顯色，測OD450。

1.2.5 Griess法檢測SjHMGB1刺激巨噬細胞后NO的分泌情況 收集上述培養(yǎng)48 h細胞的上清。按照說明書要求取標準品和待測樣品加入96孔板中（50 μL/孔），然后每孔加入50 μL Griess R1，室溫避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2，室溫避光放置5 min后，測定OD450，計算得出標準曲線并統(tǒng)計各組NO的濃度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)均利用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜ 0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義，借助Flow Jo，GraphPad Prism 5等軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析和制圖。

2 結果

2.1 SjHMGB1誘導巨噬細胞表面MHC-Ⅱ分子以及受體分子的表達情況

2.1.1 SjHMGB1誘導巨噬細胞表面MHC-Ⅱ分子上調表達 以流式細胞術檢測細胞表面MHC-Ⅱ分子的表達情況，結果顯示，未經處理的巨噬細胞低表達MHC-Ⅱ分子，但SjHMGB1和LPS的刺激能使巨噬細胞誘導性的高表達MHC-Ⅱ分子。與對照組相比，SjHMGB1蛋白能促進巨噬細胞表面高表達MHC-Ⅱ分子且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細胞表面MHC-Ⅱ分子的表達差異不具有顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 流式細胞儀分析MHC-Ⅱ分子在巨噬細胞表面的表達Fig.1 FACS analysis of MHC-Ⅱexpression on macrophagocyte注∶ **表示實驗組與對照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.05）Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**

2.1.2 SjHMGB1誘導巨噬細胞表面TLR4上調表達、TLR2下調表達 檢測結果顯示，未經處理的巨噬細胞僅少量表達TLR2、TLR4受體，SjHMGB1和LPS的刺激均能使巨噬細胞誘導性的高表達TLR4，低表達TLR2受體，與對照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 流式細胞儀分析TLR2、TLR4在巨噬細胞表面的表達Fig.2 FACS analysis of TLR2、TLR4 expression on macrophagocyte注∶ **表示實驗組與對照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義; ***表示差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**, extremely signifi cant differences(P＜0.01) were denoted by***

2.1.3 SjHMGB1誘導巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7上調表達 由圖3的流式結果可知，未經刺激的巨噬細胞能表達一定水平的CCR7，與對照組相比，SjHMGB1和LPS的刺激能上調巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7的表達水平，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細胞表面CCR7的表達差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。

2.2 SjHMGB1刺激巨噬細胞分泌細胞因子 ELISA檢測巨噬細胞分泌前炎性細胞因子TNF-α含量，由圖4可以看出， LPS刺激組和SjHMGB1刺激組中TNF-α的含量顯著高于對照組且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可見，SjHMGB1能促進巨噬細胞分泌前炎性因子TNF-α。

采用ELISA檢測巨噬細胞分泌到上清中的IL-10含量，結果見圖5。對照組與 LPS刺激組和SjHMGB1刺激組分泌的IL-10的含量差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05），由此可知，SjHMGB1并沒有促進巨噬細胞分泌抑炎因子IL-10。

2.3 SjHMGB1促進巨噬細胞分泌NO Griess檢測巨噬細胞分泌到上清中的NO含量，由圖6可以看出，與對照組相比，LPS刺激組和SjHMGB1刺激組巨噬細胞分泌NO含量高于對照組，且差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 流式細胞儀分析CCR7在巨噬細胞表面的表達Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on macrophagocyte注∶ ***表示實驗組與對照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

圖4 SjHMGB1刺激巨噬細胞產生細胞因子TNF-αFig. 4 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示實驗組與對照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group are denoted by***

圖5 SjHMGB1刺激巨噬細胞產生細胞因子IL-10Fig. 5 Cytokine IL-10 production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1

圖6 SjHMGB1刺激巨噬細胞產生NOFig. 6 NO production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示實驗組與對照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

3 討論

研究表明輻照可引起免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD），其顯著特征是通過釋放或表達所謂的危險信號分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子來增強免疫應答[11]。劉群等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1在不同發(fā)育階段血吸蟲蟲體中均有分布，且在童蟲期表達量略高，同時SjHMGB1能夠促進宿主DCs的表型成熟。HMGB1可由壞死的細胞被動釋放，相關研究結果表明，在輻照尾蚴體外轉化的童蟲細胞，SjHMGB1能夠從核內轉移至胞外。我們初步推斷在輻照致弱尾蚴/童蟲疫苗所誘導的高保護性免疫效應中，SjHMGB1作為一類蟲源性應激分子發(fā)揮了重要作用。已有研究表明輻照致弱日本血吸蟲尾蚴免疫小鼠后，可在宿主肺部和引流淋巴結等部位誘導產生高水平的、以Th1為優(yōu)勢應答的免疫保護效果?；罨拿庖呒毎鐦渫粻罴毎?、巨噬細胞和T細胞等通過分泌TNF-α和IFN-γ等細胞因子在致炎性環(huán)境的形成中發(fā)揮了關鍵作用。巨噬細胞是單核吞噬細胞系統(tǒng)中具有較強吞噬功能的細胞類型，它的一個重要功能就是通過抗原提呈參與特異性免疫應答的調節(jié)，而其表面MHC-Ⅱ分子是介導抗原提呈的一類主要分子[13]。已有研究表明在血吸蟲感染的病理進程中，巨噬細胞作為先天性免疫細胞參與其中并發(fā)揮了重要的作用。但是，SjHMGB1是否能夠在體內活化宿主巨噬細胞，從而形成有利于機體的以Th1為優(yōu)勢應答的免疫保護環(huán)境，尚需我們進一步驗證。本研究檢測SjHMGB1刺激小鼠巨噬細胞后，細胞表面的MHC-Ⅱ分子的表達量顯著增高，初步提示SjHMGB1蛋白刺激可使巨噬細胞活化，顯示抗原提呈功能。

Toll受體TLR是參與固有免疫的一類重要受體，也是連接固有免疫和適應性免疫應答的橋梁，廣泛分布于各類免疫細胞，其中TLR2、TLR4主要表達在巨噬細胞表面，其配體多是病原相關分子模式（PAMPs）。單核巨噬細胞表面的TLR與PAMPs作用后，啟動信號傳導，為巨噬細胞的成熟提供信號，增強其吞噬殺菌能力，同時釋放一系列細胞因子引起炎癥反應和參與免疫調節(jié)[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白刺激巨噬細胞后，細胞表面TLR4上調表達，TLR2下調表達，提示 SjHMGB1蛋白活化巨噬細胞可能是通過TLR4受體介導的途徑。

已有研究表明在致炎性的M1型巨噬細胞表面趨化因子受體CCR7呈現(xiàn)高表達，它能夠使免疫細胞被募集到靶器官如肺部或者引流淋巴結等部位，進而產生細胞毒效應，活化其他細胞等作用，對誘導宿主保護性免疫應答至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1蛋白刺激后可使巨噬細胞表面的CCR7上調表達，提示蛋白刺激后，巨噬細胞可能具有致炎性的M1型巨噬細胞的功能。

活化的巨噬細胞能夠合成和分泌大量的細胞因子參與免疫調節(jié)。有關研究表明TNF-α是誘導炎癥反應重要的細胞因子，在炎癥發(fā)生的早期，作為重要的早期促炎因子，參與了固有免疫和適應性免疫應答。TNF-α能夠導致炎性細胞浸潤以及增強吞噬細胞的殺傷作用。IL-10是重要的抑炎細胞因子，能誘導初始T細胞向調節(jié)性T細胞分化。因此，通過檢測巨噬細胞分泌相關細胞因子的情況就可以初步推斷巨噬細胞的功能活性。本研究通過ELISA檢測蛋白刺激巨噬細胞分泌到胞外的TNF-α和IL-10的含量，發(fā)現(xiàn)蛋白刺激能夠促進巨噬細胞TNF-α的分泌，而對IL-10的分泌無顯著差異，初步提示蛋白刺激可以使巨噬細胞的功能成熟。

活化的巨噬細胞不僅能夠分泌細胞因子，還能夠分泌NO。有研究顯示由巨噬細胞產生的NO在殺滅肺期血吸蟲童蟲時起重要作用[16]。因此，通過測定蛋白刺激巨噬細胞分泌的NO的含量變化可以反映巨噬細胞的功能活化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)SjHMGB1蛋白能夠促進巨噬細胞NO的分泌，提示巨噬細胞的炎癥反應功能被活化。但是輻照致弱日本血吸蟲來源的SjHMGB1分子在宿主體內是否也能夠通過巨噬細胞產生的NO來消除肺期的日本血吸蟲童蟲，仍有待進一步驗證。

本研究結果初步表明SjHMGB1能夠通過TLR4通路促進巨噬細胞表型及功能成熟，并誘導其向致炎性的M1型巨噬細胞分化，為形成以Th1為優(yōu)勢應答的炎性環(huán)境創(chuàng)造了條件。研究結果為進一步闡明SjHMGB1在輻照致弱血吸蟲（RAV）誘導宿主產生的高保護性免疫效應中所發(fā)揮的作用及機制提供了基礎資料。

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PRELIMINARY STUDY ON THE ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES BY HIGH MOBILITY GROUP BOX1 PROTEIN OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

LI Dan-dan1,2, MA Li-zhen1, YUAN Chun-Xiu1, SHI Xiao-na1,2, AI Min1, TA Na1, FENG Xin-gang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

This study aimed at determining the activation of high mobility group box1 protein (SjHMGB1)of Schistosoma japonicum on mouse macrophagocyte. When Recombinant SjHMGB1 protein from eukaryotic cell expression system was incubated with macrophage for 48 h, the expression of macrophage surface molecules and chemokine receptors were detected by fl ow cytometry. TNF-α and IL-10 in the culture supernatant were detected by ELISA, and the content of NO in supernatant was assayed by Griess method. Results showed that, compared with the control group, the expression levels of MHC-Ⅱmolecules, TLR4 receptor and chemokine receptor CCR7 on the surface of macrophage stimulated by SjHMGB1 group were signifi cantly increased (P ＜ 0.01), while TLR2 receptor was signi fi cantly decreased (P＜0.05). The results of test by ELISA demonstrated that SjHMGB1 could stimulate the secretion of infl ammatory factor TNF-α, and fail to promote the release of IL-10 on macrophage. The result of test using Griess method showed that SjHMGB1 could promote the secretion of NO on macrophage. The data suggest that SjHMGB1 could activate mouse macrophages via TLR4 andinduce macrophages to undergo M1-type infl ammatory polarization.

Schistosoma japonicum; high mobility group box1 protein; macrophagocyte; TLR；cytokine

S852.735

A

1674-6422（2017）01-0059-07

2016-02-02

中國農業(yè)科學院動物血吸蟲病創(chuàng)新團隊基金

李丹丹，女，碩士研究生，動物學專業(yè)

馮新港，E-mail:xingangf62@aliyun.com