趙月秋，張正寶，郭紅霞，詹傳飛，魯 皓，錢曉峰

MicroRNA-150-5p對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響

趙月秋1，張正寶1，郭紅霞1，詹傳飛2，魯 皓2，錢曉峰2

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院南京衛(wèi)生分院，江蘇 南京 210038；2.江蘇省人民醫(yī)院 肝臟外科，江蘇 南京 210029）

目的 研究microRNA-150-5p（miR-150-5p）在人正常肝細胞和肝細胞癌細胞中的表達，及其對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響及潛在機制。方法 通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測各處理組細胞中的miR-150-5p的表達水平；MTT法檢測miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖的影響；流式細胞術檢測miR-150-5p對肝細胞癌細胞凋亡和周期的影響；熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測鋅指蛋白609是否為miR-150-5p的直接靶基因。結(jié)果 miR-150-5p在肝細胞癌細胞系中的表達較人正常肝細胞細胞系降低，miR-150-5p可抑制肝細胞癌細胞的增殖，促進肝細胞癌細胞的凋亡，并阻滯細胞周期于G1期。miR-150-5p在肝細胞癌中發(fā)揮腫瘤抑制分子作用的潛在機制為直接靶向抑制ZNF609的表達。結(jié)論 miR-150-5p在肝細胞癌細胞中表達降低，并可通過調(diào)控ZNF609的表達而調(diào)控肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期。

MicroRNA-150-5p；增殖；凋亡；周期；ZNF609

在全球范圍內(nèi)，肝細胞癌發(fā)病率高居所有惡性腫瘤的第5位，值得注意的是，近年來肝細胞癌在東亞和發(fā)展中的發(fā)病率正逐步上升[1-2]。盡管在過去數(shù)10年間，肝細胞癌的治療手段取得巨大的進步，但大多數(shù)患者術后發(fā)生復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，導致肝細胞癌的致死率仍居高不下[3]。截止目前，肝細胞癌發(fā)生、進展中的分子機制仍不完全清楚。因此，尋找與肝細胞癌發(fā)生及進展相關的分子，對提高肝細胞癌患者術后生存率至關重要。

MicroRNA（miRNA）是一類可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的18-22個核苷酸大小的非編碼小分子。miRNA在進化過程中發(fā)育相近的物種之間高度保守，被視為細胞增殖、細胞分化和腫瘤發(fā)生的關鍵調(diào)控分子[4-6]。在肝細胞癌中，多種miRNA被發(fā)現(xiàn)可作為癌基因或抑癌基因參與調(diào)控肝細胞癌的發(fā)生、進展，如miR-214[7]、miR-182[8]、miR-29b[9]、miR-7等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p在肝細胞癌組織中表達下調(diào)，并可抑制肝細胞癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，但miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響及潛在分子機制，目前尚不清楚。本研究擬采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerasechainreaction，qRT-PCR）方法檢測miR-150-5p在正常肝細胞系和肝細胞癌細胞系中的表達差異，及其對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Quant一步法逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，miR-150-5p正常對照（normal control，NC）和miR-150-5p類似物（Mimics）由上海吉瑪公司設計并合成，脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2 000）試劑購于美國Invitrogen公司，MTT試劑盒購自美國Promega公司，流式細胞術所用FITC標記的Annexin-V及PI試劑購自美國BioLegend公司，人正常肝細胞系QZG細胞和HL-7702細胞，肝細胞癌細胞系HepG2細胞和SMMC-7221細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人正常肝細胞和肝細胞癌細胞系用含100 ml/L胎牛血清的1 640培養(yǎng)液，置于溫度37℃，50 ml/L二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當肝細胞癌細胞密度達到約70%后，將miR-150-5p NC和miR-150-5p類似物經(jīng)LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)入細胞中，具體操作步驟參見脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2 000）試劑說明書。

1.2.2 qRT-PCR 按照培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒說明書所述方法提取各實驗組細胞，而后采用Quant一步法逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒所述方法行qRT-PCR，具體步驟如下：按說明書所述依次加入試劑后行一步法qRT-PCR。qRT-PCR反應條件為：50℃30 min，95℃2 min，35個循環(huán)94℃20 s，60℃20 s，65℃20 s。

1.2.3 MTT 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，取對數(shù)生長期的肝細胞癌細胞，制備單細胞懸液，以5.0×103個/孔細胞密度接種于96孔板，每組設8個復孔，分別培養(yǎng)1～5 d，每孔加入20 μl濃度為1.5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μl DMSO，讀取吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 流式細胞術 細胞周期檢測方法簡述如下，取轉(zhuǎn)染48h后的各組細胞，5ml PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，5 ml PBS洗滌3次后，棄上清液；加入100μl流式洗液，PI（50μg/ml）10μl，避光反應10 min后，加入400μl流式洗液，200目尼龍膜過濾細胞，立即利用流式細胞儀上機檢測。如檢測細胞凋亡，加入抗體步驟時同時加入FITC標記的Annexin-V和PI各10μl及同型對照抗體，其余步驟同檢測細胞周期。細胞周期和細胞凋亡數(shù)據(jù)后期均采用Flowjo 7.2軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌細胞和正常肝細胞中miR-150-5p的表達差異

為研究人正常肝細胞系與肝癌細胞系中miR-150-5p的表達情況，分別提取人正常肝細胞系QZG和 HL-7702細胞和肝細胞癌細胞系HepG2和SMMC-7221細胞的總RNA，采用一步法qRT-PCR檢測各細胞中miR-150-5p的相對表達量，經(jīng)方差分析，4組細胞中miR-150-5p表達差異有統(tǒng)計學意義（F=9.125，P=0.018），提示miR-150-5p在4組細胞系中表達差異有統(tǒng)計學意義。進一步t檢驗分析兩兩細胞系中miR-150-5p的表達差異，結(jié)果顯示肝細胞癌細胞系中的miR-150-5p的表達水平較正常肝細胞降低（QZG vs HL-7702，t=0.324，P=0.419；QZG vs HepG2，t=7.748，P=0.031；QZG vs SMMC-7221，t= 5.197，P=0.039），結(jié)果提示，miR-150-5p在肝細胞癌中表達降低，是潛在的腫瘤抑制分子。見圖1。

2.2 miR-150-5p mimics上調(diào)肝細胞癌細胞中的miR-150-5p的表達

為研究miR-150-5p對肝細胞癌增殖、凋亡、周期的影響，合成miR-150-5p mimics，并轉(zhuǎn)染至細胞中觀察miR-150-5p mimics是否可以上調(diào)肝細胞癌細胞中的miR-150-5p的表達水平。轉(zhuǎn)染miR-150-5p NC的肝細胞癌細胞命名為miR-150-5p NC組，轉(zhuǎn)染miR-150-5p mimics的肝細胞癌細胞命名為miR-150-5p mimics組。轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取各組細胞總RNA，采用一步法qRT-PCR檢測各組細胞中miR-150-5p的相對表達量，結(jié)果顯示miR-150-5p mimics組的miR-150-5p的相對表達量較miR-150-5p NC組上調(diào)（HepG2細胞：t=5.114，P=0.017；SMMC-7221細胞：t=3.716，P=0.032），結(jié)果提示miR-150-5p可上調(diào)肝細胞癌細胞中miR-150-5p的表達水平。見圖2。

圖2 miR-150-5p在miR-150-5p NC組和miR-150-5p mimics組肝細胞癌細胞中的表達水平

2.3 miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖的影響

為研究miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖能力的影響，利用MTT實驗檢測轉(zhuǎn)染miR150-5p-NC與miR-150-5p mimics的肝細胞癌 HepG2細胞和SMMC-7221細胞的細胞增殖的差異。結(jié)果顯示，從檢測后第2天開始，miR-150-5p mimics組的肝細胞癌細胞增殖較miR-150-5p NC組出現(xiàn)明顯的生長抑制（HepG2細胞：t=4.146，P=0.022；SMMC-7221細胞：t=3.193，P=0.041），結(jié)果提示，提高肝細胞癌細胞中miR-150-5p的表達可抑制肝細胞癌細胞的增殖。見圖3。

2.4 miR-150-5對肝細胞癌細胞凋亡的影響

為研究miR-150-5p對肝細胞癌細胞凋亡水平的影響，利用流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染miR150-5p-NC與miR-150-5p mimics的肝細胞癌HepG2細胞和SMMC-7221細胞的細胞凋亡的差異。結(jié)果顯示，在HepG2細胞中，miR-150-5p NC組細胞凋亡率為（2.146±0.327），miR-150-5p mimics組細胞凋亡率為（7.335±1.714），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t= 10.332，P=0.012）。在SMMC-7221細胞中，miR-150-5p NC組細胞凋亡率為（3.159±0.273）%，miR-150-5p mimics組細胞凋亡率為（14.719±3.154）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.415，P=0.009）。與miR-150-5pNC組比較，miR-150-5p mimics組的肝細胞癌細胞的細胞凋亡率升高。以上結(jié)果提示，上調(diào)肝細胞癌細胞中miR-150-5p的表達水平可促進肝細胞癌細胞的凋亡，進一步證實miR-150-5p是潛在的腫瘤抑制分子。見圖4。

圖3 miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖的影響

2.5 miR-150-5對肝細胞癌細胞周期的影響

圖4 miR-150-5p對肝細胞癌細胞凋亡的影響

為研究miR-150-5p對肝細胞癌細胞周期的影響，利用流式細胞術檢測分別轉(zhuǎn)染miR-150-5p NC與miR-150-5p的肝細胞癌HepG2細胞和SMMC-7221細胞的細胞周期的差異。結(jié)果顯示，在HepG2細胞中，miR-150-5p NC組細胞合成期（synthesis phase，S期）細胞比率為（21.324±4.718）%，miR-150-5p mimics組S期細胞比率為（11.674±4.120）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.416，P=0.021）。在SMMC-7221細胞中，miR-150-5p NC組S期細胞比率為（29.728±5.723）%，miR-150-5p mimics組S期細胞比率為（18.344±4.115）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.195，P=0.034）。與miR-150-5p NC組比較，miR-150-5pmimcs組的肝細胞癌細胞的S期細胞的細胞比率降低，細胞周期被阻滯于第一間隙期（gap phase 1，G1期）。以上結(jié)果提示，上調(diào)肝細胞癌細胞中miR-150-5p的表達，可是細胞周期阻滯于G1期，增殖期S其細胞數(shù)目減少，細胞增殖收到抑制。見圖5。

2.6 miR-150-5p在肝細胞癌細胞系中靶向抑制ZNF609

圖5 miR-150-5p對肝細胞癌細胞周期的影響

為進一步研究miR-150-5p在肝細胞癌中發(fā)揮抑癌作用的機制，綜合分析Target Scan 6.2和miRBse數(shù)據(jù)庫中miR-150-5p的潛在靶分子。生物信息學提示鋅指蛋白609（Zinc finger protein 609，ZNF609）為miR-150-5p新的潛在靶分子。Luciferase結(jié)果顯示，在肝細胞癌細胞系中ZNF609為miR-150-5p直接靶基因（P=0.031）（見圖6A）。進一步實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-150-5p-mimics的肝細胞癌HepG2細胞和SMMC-7721中ZNF609的mRNA表達水平降低（P=0.015）（見圖6B），以上結(jié)果提示，ZNF609為miR-150-5p在肝細胞癌細胞中的直接靶分子，miR-150-5p可直接抑制肝細胞癌細胞中ZNF609的表達水平。因此，miR-150-5p在肝細胞癌中發(fā)揮腫瘤抑制分子作用的潛在機制為直接靶向抑制ZNF609的表達。

圖6 miR-150-5P在肝細胞癌細胞系中靶向抑制ZNF609的表達

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p在多種腫瘤中異常表達并參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性表型。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)，miR-150-5p低表達的結(jié)腸癌患者的總體生存率縮短，對化療的反應較miR-150高表達組也下降[12]。此外，miR-150可通過靶向抑制MUC4的表達而抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。在食管鱗狀細胞癌中組織中，miR-150表達較正常食管黏膜下降[14]。miR-150可通過抑制ZEB1的表達而抑制食管鱗狀細胞癌細胞和卵巢癌細胞的侵襲能力[14-15]。相反，也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在肺癌中表達上調(diào)，并可通過靶向抑制SRC激酶信號通知抑制分子1的表達而促進肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。關于miR-150-5p在肝細胞癌中的表達及功能的研究尚不多，研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p在肝細胞癌組織中表達下調(diào)[17]，并可通過靶向調(diào)控MMP14分子而抑制肝細胞癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[11]。但目前尚無研究關注，miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響。

本研究采用qRT-PCR法檢測人正常肝細胞系和肝細胞癌細胞系中miR-150-5p的表達差異，并利用 miR-150-5p mimics提高肝細胞細胞系中miR-150-5p的表達，而后采用MTT和流式細胞術等方法檢測miR-150-5p對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的影響。與既往文獻相符，研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p在肝細胞癌細胞系HepG2和SMMC-7221中的表達較人正常肝細胞細胞系QZG和HL-7702中的表達降低。上調(diào)肝細胞癌細胞中miR-150-5p的表達后，肝細胞癌系細胞的增殖受到抑制，而細胞凋亡比率則升高。此外，細胞周期也被阻滯于G1期。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p在肝細胞癌中發(fā)揮腫瘤抑制分子作用的潛在機制為直接靶向抑制ZNF609的表達。

多項研究表明，miRNA在肝細胞癌的發(fā)生及進展中扮演著重要的角色。例如，miR-195在肝細胞癌組織中表達下調(diào)，并與肝細胞癌的血管生成、遠處轉(zhuǎn)移和無病生存期呈負相關[18]。MiR-195發(fā)揮抑癌作用的潛在機制為其通過靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和促轉(zhuǎn)移因子VAV2和CDC42的表達而抑制肝細胞癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。MiR-140-5p在肝細胞癌中同樣表達下調(diào)，其表達水平與肝細胞癌多發(fā)結(jié)節(jié)、靜脈侵犯程度、囊形成、細胞核分化水平和總體積無病生存期密切相關[19]。本研究證實，miR-150-5p在肝細胞癌細胞中表達下調(diào)并在肝細胞癌中發(fā)揮腫瘤抑制分子的作用，其可通過調(diào)控ZNF609的表達水平而參與調(diào)控肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p在肝細胞癌細胞系中的表達較人正常肝細胞系下降，提高miR-150-5p在肝細胞癌細胞中的表達，可抑制肝細胞癌細胞的增殖能力，并促進腫瘤細胞的凋亡率。此外，與NC組比較，miR-150-5p mimics組細胞周期中S期細胞所占比例也降低。進一步的研究顯示，miR-150-5p在肝細胞癌細胞中發(fā)揮抑癌分子作用的潛在機制為其靶向抑制ZNF609的表達。本研究進一步揭示，miR-150-5p在肝細胞癌中的表達及其對肝細胞癌細胞增殖、凋亡和周期的作用，為肝細胞癌的治療提供潛在的分子靶點。

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（張西倩 編輯）

Effects of miR-150-5p on proliferation,apoptosis and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells

Yue-qiu Zhao1,Zheng-bao Zhang1,Hong-xia Guo1,Chuan-fei Zhan2,Hao Lu2,Xiao-feng Qian2
(1.Nanjing Health School,Jiangsu Union Technical Institute,Nanjing,Jiangsu 210038,China;2. Department of Liver Surgery,Jiangsu Provincial Hospital,Nanjing,Jiangsu 210029,China)

Objective To investigate the expression and effect of miR-150-5p on cell proliferation,cell apoptosis and cell cycle in human hepatocellular carcinoma cells.Methods The expression of miR-150-5p in hepatocellular carcinoma cells and normal human liver cells was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR).Proliferation of hepatocellular carcinoma cells was analyzed by MTT.Cell apoptosis and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells were analyzed by flow cytometry.Luciferase assay was performed to detect whether ZNF609 was the direct target of miR-150-5p in the hepatocellular carcinoma cells.Results The expression of miR-150-5p was significantly down regulated in the hepatocellular carcinoma cells compared to the normal human liver cells.Proliferation of the hepatocellular carcinoma cells was significantly inhibited by miR-150-5p,but cell apoptosis was significantly promoted.Cell cycle of the hepat ocellular carcinoma cells was arrested at G1 phage after transfection of miR-150-5p mimics.Further investigation proved ZNF609 was the direct target of miR-150-5p in hepatocellular carcinoma cells.Conclusions miR-150-5p may function as tumor suppressor and play important roles in cell proliferation,cell apoptosis and cell cycle in hepatocellular carcinoma cells by directly targeting ZNF609.

miR-150-5p;cell proliferation;cell apoptosis;cell cycle;ZNF609

臨床研究·論著

R735

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.006

1005-8982（2017）04-0027-06

2016-07-13