宋桂芹，徐志偉，李 澤，李向上，張效云

不同品系小鼠肺纖維化模型的比較研究*

宋桂芹1，徐志偉1，李 澤2，李向上2，張效云1

（河北北方學(xué)院1.生物化學(xué)教研室，2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000）

目的 通過(guò)對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)3個(gè)不同品系小鼠肺纖維化程度的比較研究，尋找最適合研究肺纖維化的小鼠模型。方法 選用C57BL/6、BALB/c以及KM 3種品系的小鼠，分別設(shè)為模型組和對(duì)照組。模型組向氣管注射博來(lái)霉素（5 mg/kg），正常對(duì)照組注入等量的生理鹽水。3個(gè)品系的小鼠分別于造模后的第7天、14天和28天處死8只，觀察在不同的時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)、羥脯氨酸含量的變化以及通過(guò)Masson染色觀察肺纖維化程度的改變。結(jié)果 各模型組不同時(shí)間點(diǎn)的肺系數(shù)、羥脯氨酸含量和肺組織的病理學(xué)改變積分與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C57BL/6模型組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)、羥脯氨酸含量和肺組織病理學(xué)改變積分與BALB/c和KM比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 C57BL/6小鼠對(duì)博來(lái)霉素反應(yīng)敏感，肺纖維化明顯，是3個(gè)品系小鼠中研究肺纖維化的最理想模型。

肺纖維化；博來(lái)霉素；小鼠

肺纖維化是一種病因不明的間質(zhì)性肺疾病，其以彌漫性肺泡炎、成纖維細(xì)胞病理性增生和細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)及肺泡腔沉積等為其病理特征[1-3]。目前，臨床上缺乏有效的治療手段，病死率極高[4]。纖維化的病變部位主要是肺間質(zhì)，也可涉及肺血管以及上皮細(xì)胞[5]。復(fù)制理想的肺纖維化模型是探討人類肺纖維化的發(fā)病機(jī)制基本保障，同時(shí)也是進(jìn)行臨床上研發(fā)肺纖維化治療藥物的基本保證。小鼠具有繁殖快、飼養(yǎng)管理費(fèi)用低等特點(diǎn)，成為廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是在生命科學(xué)研究中，被應(yīng)用于腫瘤、免疫、微生物、生殖生理等領(lǐng)域。在有關(guān)肺纖維化的一系列科學(xué)研究中，小鼠是科研工作者最常選用的動(dòng)物。但是究竟哪一種品系的小鼠更適合作為肺纖維化的模型，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究以KM、C57BL/6及BALB/c 3個(gè)品系小鼠作為研究對(duì)象，尋找最適合復(fù)制肺纖維化模型的小鼠。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠C57BL/6、BALB/c和KM各48只，6～8周齡，雄性，體重（20±2）g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。標(biāo)記動(dòng)物后分籠飼養(yǎng)，溫度為18～24℃，光暗周期交替。

1.1.2 主要試劑與器材 博來(lái)霉素購(gòu)自日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)640110，羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，Masson染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，普通光學(xué)顯微鏡，722分光光度計(jì)

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將3個(gè)品系小鼠各隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，均為24例。

1.2.2 肺纖維化模型制作 各組小鼠稱重后，用3.5%水合氯醛注射液腹腔麻醉（0.1 ml/10 g），向各模型組小鼠氣管內(nèi)注入生理鹽水溶解的博來(lái)霉素（5 mg/kg）0.1 ml，向各對(duì)照組小鼠注入等量生理鹽水，動(dòng)物清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。分別于飼養(yǎng)后的第7、14和28天處死小鼠，分離全肺并除去脂肪組織，生理鹽水清洗表面，濾紙吸干多余水份，稱全肺濕重，并計(jì)算肺系數(shù)。取右肺凍于液氮置入-70℃冰箱冷凍保存，用于肺組織羥脯氨酸的測(cè)定。左肺經(jīng)4%多聚甲醛固定后制備石蠟切片，進(jìn)行Masson 3色染色比較分析研究。

1.2.3 肺組織羥脯氨酸試劑盒測(cè)定 肺組織羥脯氨酸的測(cè)定采用堿水解法[6]，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 肺系數(shù)計(jì)算 記錄小鼠體重。小鼠處死后分離全肺并去除脂肪組織，生理鹽水清洗表面后濾紙吸干多余水分，稱全肺濕重并計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺濕重（mg）/體重（g）。

1.2.5 小鼠肺組織病理學(xué)檢查 取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水、浸蠟和包埋后制作厚度4μm石蠟切片進(jìn)行Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變，并且參照SZAPIEL等[7]提出的肺纖維化分級(jí)法進(jìn)行評(píng)分。肺纖維化程度的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)纖維化，積分是0分；1級(jí)，輕度纖維化，且面積小于全肺的20%，積分是1分；2級(jí)，中度纖維化，且面積占全肺20%～50%，積分是2分；3級(jí)，重度纖維化，且面積占全肺50%以上，肺泡結(jié)構(gòu)非常紊亂，積分是3分。通過(guò)觀察分析得到不同品系的小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化程度的總積分，進(jìn)而求得平均積分（平均積分=總積分/例數(shù)）對(duì)肺纖維化程度進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用SNK法做兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)品系小鼠的一般情況

3個(gè)品系的小鼠中，對(duì)照組均表現(xiàn)出精神狀態(tài)好，飲水和飲食正常，體重都有不同程度的增加。在博來(lái)霉素組的不同品系小鼠在造模后不久出現(xiàn)了不同程度的飲食及飲水減少、活動(dòng)度下降、精神萎靡、毛發(fā)干枯及體重下降等情況。BALB/c以及KM在造模后1周左右，大多數(shù)小鼠的情況漸漸趨于好轉(zhuǎn)。C57BL/6體重下降最顯著，并且在造模后的第9天體重又開(kāi)始回升并趨于穩(wěn)定。C57BL/6小鼠在用藥后第11天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至第28天共有3例小鼠死亡。BALB/c以及KM小鼠均無(wú)死亡現(xiàn)象。

2.2 3個(gè)品系小鼠肺組織羥脯氨酸含量的比較

3個(gè)不同品系小鼠的模型組羥脯氨酸含量在第7、14和28天均高于對(duì)照組（P＜0.05）；C57BL/6小鼠模型組的羥脯氨酸含量在不同時(shí)間點(diǎn)與其他品系小鼠模型組比較，增加更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；KM、BALB/c小鼠的模型組在不同時(shí)間點(diǎn)的HYP含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 3個(gè)品系小鼠肺系數(shù)的比較

如表2所示，3個(gè)不同品系的小鼠的模型組肺系數(shù)在第7、14和28天均高于對(duì)照組（P＜0.05），C57BL/6小鼠模型組的肺系數(shù)與KM、BALB/c小鼠模型組在不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），KM、BALB/c小鼠的模型組在不同時(shí)間點(diǎn)的肺系數(shù)的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3個(gè)品系小鼠羥脯氨酸的含量 （n=24，μg/mg，x±s）

表2 3個(gè)品系小鼠肺系數(shù) （x±s）

2.4 3個(gè)品系小鼠模型組肺組織的病理學(xué)積分的比較

Masson染色評(píng)定3個(gè)品系小鼠模型組的肺組織病理學(xué)積分，各品系小鼠對(duì)照組均沒(méi)有出現(xiàn)肺組織纖維化。C57BL/6小鼠與KM、BALB/c小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C57BL/6小鼠模型組的肺組織病理學(xué)積分與KM、BALB/c小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），KM、BALB/c小鼠的模型組在不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)積分的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 3個(gè)品系小鼠肺組織纖維化病理學(xué)積分 （x±s）

3 討論

博來(lái)霉素是一種從輪生鏈霉菌中提取的廣譜的抗腫瘤的藥物，具有引起肺纖維化的副作用[8]。而由博來(lái)霉素誘導(dǎo)動(dòng)物肺纖維化模型的生理學(xué)以及病理組織學(xué)的發(fā)展過(guò)程與人類的肺纖維化非常相似，所以博來(lái)霉素成為國(guó)內(nèi)外制作肺纖維化模型最常用的藥物[9]。在利用博來(lái)霉素造模時(shí)，可以采用腹腔、靜脈、皮下、氣管等多種途徑給藥，但是通過(guò)氣管給藥是制備肺纖維化目前最常用的方法[10]。不同種屬的動(dòng)物對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化的反應(yīng)程度不同[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管注入博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化，比較不同品系的小鼠在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度的差異。

肺組織羥脯氨酸的測(cè)定、肺系數(shù)計(jì)算、小鼠肺組織病理學(xué)檢查是判斷肺組織纖維化的主要指標(biāo)。羥脯氨酸是機(jī)體膠原蛋白中的一種特有的組成成分，約占到其氨基酸總量的13.4%，并且?guī)缀跛械牧u脯氨酸均存在于膠原中，因此羥脯氨酸的測(cè)定能夠間接反映肺組織中膠原的含量，以此可被用來(lái)評(píng)估肺纖維化的程度[12]。肺系數(shù)是通過(guò)肺濕重（mg）/體重（g）計(jì)算得到，因此其數(shù)值的高低與肺濕重和體重密切相關(guān)。在肺纖維化形成的進(jìn)程中，炎癥細(xì)胞的滲出、毛細(xì)血管充血、細(xì)胞出現(xiàn)腫脹以及膠原纖維的沉積等多種因素均可導(dǎo)致肺濕重增加，進(jìn)而引起肺系數(shù)升高。另外，造模后的小鼠處于疾病狀態(tài)，體重增長(zhǎng)緩慢或者持續(xù)下降，也是導(dǎo)致肺系數(shù)增加的直接原因[13]。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)肺組織羥脯氨酸試劑盒測(cè)定羥脯氨酸的含量，精確分離小鼠的全肺計(jì)算肺系數(shù)以及在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠組織病理學(xué)改變，比較在相同的造模條件下，不同品系的小鼠肺纖維化的變化程度。本實(shí)驗(yàn)觀察到，造模后第7天、14天和28天，3個(gè)品系的模型組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肺纖維化，其中C57BL/6模型組小鼠與BALB/c和KM模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而KM、BALB/c小鼠的模型組在不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，博來(lái)霉素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠形成肺纖維化程度明顯，是3個(gè)品系小鼠中最適合用于復(fù)制肺纖維化模型。

KM小鼠是一類繁殖力、抗病力和適應(yīng)力均很強(qiáng)的遠(yuǎn)交群小鼠，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)等多種領(lǐng)域的研究[14]。BALB/c和C57BL/6是兩種國(guó)內(nèi)最常用且遺傳背景差異較大的近交系小鼠。BALB/c小鼠乳腺癌的發(fā)病率較低，其他腫瘤如肺癌、卵巢癌等有一定的發(fā)病率，具有對(duì)麻疹病毒中度敏感、對(duì)放射線極為敏感等特性，被應(yīng)用于研究腫瘤、核醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。C57BL/6小鼠常被認(rèn)作是標(biāo)準(zhǔn)的“近交系”，群體反應(yīng)性比較均一，具有對(duì)放射性物質(zhì)耐受中等、對(duì)結(jié)核桿菌比較敏感、乳腺腫瘤的自然發(fā)病率低以及干擾素產(chǎn)量高等特性，廣泛應(yīng)用于生理學(xué)、腫瘤學(xué)與遺傳學(xué)等方面的研究。艾必燕等[15]對(duì)C57BL/6小鼠呼吸系統(tǒng)組織進(jìn)行詳細(xì)、系統(tǒng)地組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠的呼吸系統(tǒng)組織與人體的呼吸系統(tǒng)的主要差異在于氣管腺，肺組織中實(shí)質(zhì)和間質(zhì)部分組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人類的差異不大。肺纖維化是一種肺間質(zhì)的疾病，而C57BL/6小鼠肺組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)接近于人類，其作為肺纖維化的模型能夠最大程度地模擬人的肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和過(guò)程，推測(cè)C57BL/6小鼠是制作肺纖維化模型的最佳選擇。本研究通過(guò)3個(gè)品系小鼠造模后的第7天、14天和28天的肺纖維化指標(biāo)的比較，得出C57BL/6小鼠是3個(gè)品系中最適合復(fù)制肺纖維化模型的小鼠，與上述推斷的結(jié)果一致。

選用博來(lái)霉素氣管給藥的誘導(dǎo)方式，選擇C57BL/6小鼠復(fù)制肺纖維化模型，過(guò)程比較簡(jiǎn)單，可重復(fù)性也比較高，且與人的肺纖維化的發(fā)病過(guò)程和機(jī)制比較相似，是良好的肺纖維化模型，不過(guò)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，該品種小鼠的死亡率最高，這也是目前研究中急需解決的問(wèn)題，并且C57BL/6小鼠易于誘發(fā)形成肺纖維的機(jī)制值得進(jìn)一步研究和探討。

[1]KING T J,PARDO A,SELMAN M.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].Lancet,2011,378(9807):1949-1961.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).特發(fā)性肺（間質(zhì)）纖維化診斷和治療指南（草案）[J].中華結(jié)合和呼吸雜志,2002,25(7):387-388.

[3]吳桂花,劉曉慧,程兆忠,等.骨化三醇干預(yù)博來(lái)霉素所致肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].青島醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,52(1):57-60.

[4]COLLARD H R,PANTILAT S Z.Dyspnea in interstitial lung disease[J].Pantilat Current Opinion in Supportive and Palliative Care,2008,2(2):100-104.

[5]田莉瑩,于文成.特發(fā)性肺纖維化的研究進(jìn)展[J].青島醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,49(3):279-282.

[6]ZHU T,JIN H,XIAO M,et al.Protective role of andrographolide in bleomycin-inuced pulmonary fibrosis in mice[J].Int J Mol Sci,2013,14(12):23581-23596.

[7]SZAPIEL S V,ELSON N A,FULMER J D,et al.Bleomycin-in duced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J]. Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[8]周平,王磊,何春香,等.博來(lái)霉素和油酸致大鼠肺纖維化病理模型的比較[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2015,15(87):47-50.

[9]JAFARIAN-DCHKORDI A,RABBANI M.Development and timcourse of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in NMRI mice[J]. DARU,2007,15(1):1-6.

[10]陶章,李惠萍.不同劑量博來(lái)霉素致小鼠纖維化模型的比較[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(7):12114-1218.

[11]CHUA F,GAULDIE J,LAURENT G J.Pulmonary fibrosis: searching for model answers[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2005,33(1):9-13.

[12]楊成林,周語(yǔ)平.理肺化纖方對(duì)肺纖維化大鼠的防治作用和對(duì)肺功能及血清、組織羥脯氨酸含量的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(9):194-198.

[13]王亮,曾紅藍(lán),周遠(yuǎn)航,等.加味小苦辛湯對(duì)博來(lái)霉素肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺系數(shù)及HYP含量的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2014,12(8):151-153.

[14]楊珊珊,賈曉明,趙杰,等.三個(gè)品系小鼠百草枯肺纖維化模型的比較[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):456-459.

[15]艾必燕,陳俊穎,鄧玉江,等.C57BL6小鼠呼吸系統(tǒng)組織學(xué)特征研究[J].局部手術(shù)學(xué)雜志,2012,21(2):117-119.

（張蕾 編輯）

Comparative study on pulmonary fibrosis model induced by Bleomycin in three strains of mice*

Gui-qin Song1,Zhi-wei Xu1,Ze Li2,Xiang-shang Li2,Xiao-yun Zhang1
(1.Department of Biochemistry,2.College of Laboratory Medicine,Hebei North University, Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To find out the most proper model of human pulmonary fibrosis through a comparative study of pulmonary fibrosis in three strains of mice induced by Bleomycin(BLM).Methods C57BL/6,BALB/c and KM mice were randomly divided into model groups and normal control groups,respectively.Three model groups received a single intratracheal instillation of 5 mg/kg body weight of BLM to induce pulmonary fibrosis,while normal control groups were administrated the same amount of normal saline.On the 7th,14th and 28th day,8 mice were respectively sacrificed in each model group.Lung tissues were removed to measure the lung coefficient and hydroxyproline content of the mice at different time points,and Masson staining was used to evaluate the extent of pulmonary fibrosis.Results The lung coefficient,hydroxyproline content and pulmonary histopathological changes of each model group were remarkably different from those of the corresponding normal control group(P＜0.05). Compared with the BALB/c and KM model groups,the lung coefficient,hydroxyproline content and pulmonary histopathological changes of the C57BL/6 model group were significantly increased(P＜0.05).Conclusions C57BL/6 is more suitable for the model of pulmonary fibrosis in the three strains of mice because of sensitive Bleomycin reaction and obvious pulmonary fibrosis.Of the three strains,C57BL/6 is the most suitable model in studying pulmonary fibrosis.

pulmonary fibrosis;Bleomycin;mouse

R-332；R563

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.003

1005-8982（2017）04-0013-04

2016-04-11

張家口市科技局自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No：-12110046D-1）

張效云，Tel：0313-4029270；E-mail：xyzonly928@163.com