盧旭，許光輝，黃亦琦*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué) ，福建 福州 360122；2.廈門市醫(yī)藥研究所，福建 廈門 361008）

兔耳痤瘡角質(zhì)化模型試驗(yàn)

盧旭1,2，許光輝2，黃亦琦2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué) ，福建 福州 360122；2.廈門市醫(yī)藥研究所，福建 廈門 361008）

目的采用煤焦油復(fù)制兔耳痤瘡模型。方法隨機(jī)將9只雄性家兔隨機(jī)分為A組、B組、C組。A組耳導(dǎo)管開口處約2cm×2cm范圍涂生理鹽水，B、C組涂煤焦油，連續(xù)涂14 d后，判斷模型是否成功。結(jié)果A組兔耳薄白，B組、C組的兔耳表面粗糙、增厚，肉眼觀察到不同大小紅斑，局部有小顆粒隆起，毛孔增大，有黑色物質(zhì)堵塞毛孔。組織切片觀察：A組皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，B、C組皮膚組織肥厚、角質(zhì)化，皮膚組織結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論煤焦油用玉米油稀釋制備耳痤瘡角質(zhì)化模型的方法有效。

痤瘡；動(dòng)物模型；煤焦油；兔耳

痤瘡是好發(fā)于毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，皮脂分泌過多，堵塞毛孔，促進(jìn)痤瘡桿菌、金黃葡萄球菌生長，侵害皮膚組織，導(dǎo)致毛囊口角化過度，是本病發(fā)病的重要基礎(chǔ)和機(jī)制，炎癥、感染是痤瘡的發(fā)病因素[1]，自然愈合時(shí)間長，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，身心健康。本試驗(yàn)旨在制備模擬臨床癥狀的痤瘡角質(zhì)化模型，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

新西蘭家兔，普通級(jí)，1.8～2.2 kg，雄性，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。

1.2 儀器

電子天平ME1002(瑞士梅特勒·托利多公司)；組織脫水機(jī)TP1020、顯微鏡DM500、石蠟切片機(jī)RM2235、包埋機(jī)EG1150H(德國Leica公司)。

1.3 試 劑

煤焦油（Alfa Aesar（China）公司）；玉米油（中國益海嘉里營銷有限公司）；余試劑為分析純。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模

隨機(jī)將9只雄性家兔隨機(jī)分為A組、B組、C組各3只，并編號(hào)。A組涂生理鹽水（對(duì)照組），B組涂2%煤焦油，C組涂4%煤焦油，用無菌棉簽均勻涂于家兔耳內(nèi)側(cè)面耳導(dǎo)管開口處約2 cm×2 cm 范圍，每天1次，每次0.5 mL，并且用溫水擦拭前次涂藥部位，連續(xù)涂14 d，末次涂12 h后，觀察，處死，取材，制作病理切片[2]。

2.2 造模結(jié)果評(píng)價(jià)

表1 煤焦油對(duì)兔耳的干預(yù)效果（n=6）

圖1 煤焦油對(duì)兔耳模型的干預(yù)結(jié)果

圖2 煤焦油對(duì)兔耳皮膚組織影響的病理觀察

使用5 mm打孔器在涂藥部位打孔制備耳片，10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后，每個(gè)樣品做連續(xù)5個(gè)切片，取較完整皮膚結(jié)構(gòu)的切片進(jìn)行病理組織學(xué)觀察分析。

痤瘡模型組織學(xué)判定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]：按組織學(xué)級(jí)別為3 級(jí)。0級(jí)為無痤瘡表現(xiàn)（-）；1級(jí)為兔耳表面皮膚發(fā)紅，或毛囊漏斗部見少量致密角化物質(zhì)(+)；2級(jí)為毛囊漏斗部見中等致密角化物質(zhì)，并向皮脂腺延伸(++)；3級(jí)為毛囊內(nèi)有廣泛的角化物質(zhì)、皮膚凸起、瘢痕(+++)。進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)（表1），B、C組均與A組對(duì)照，以觀察痤瘡模型是否復(fù)制成功。

3 結(jié) 果

涂煤焦油14 d后，A組兔耳柔軟、薄白，毛細(xì)血管清晰，兔耳管開口處可見毛孔大小均勻，皮膚組織完整。B組、C組的皮膚表面粗糙、增厚，肉眼觀察到不同大小紅斑，小顆粒隆起，毛孔增大，不同程度角質(zhì)化，局部有黑色物質(zhì)堵塞毛孔（圖1）。組織切片觀察：不同程度的顆粒層、棘層肥厚，毛囊口角質(zhì)化，皮膚組織結(jié)構(gòu)被破壞（圖2）。結(jié)果提示兔耳痤瘡角質(zhì)化模型復(fù)制成功，煤焦油用玉米油稀釋制備耳痤瘡角質(zhì)化模型的方法有效。

4 討 論

雄激素刺激皮脂腺細(xì)胞的增生與分泌，雄激素中的睪酮在酶的作用下，與相應(yīng)受體結(jié)合，調(diào)控毛囊皮脂腺的活動(dòng)，使皮脂腺異常角化[4]。皮膚角質(zhì)化，皮脂分泌過多導(dǎo)致皮脂腺功能異常，局部代謝障礙，細(xì)菌滯留、繁殖，產(chǎn)生炎癥。無論是痤瘡毛囊皮脂腺角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生，還是炎性皮損處，皮膚免疫系統(tǒng)都參與[5]。Jugean 等[6]認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌可誘導(dǎo)TLR表達(dá)，此機(jī)制在痤瘡炎癥反應(yīng)中可能起到重要作用。昝文華等[7]發(fā)現(xiàn)，痤瘡皮損處檢出痤瘡丙酸桿菌，多伴金黃色葡萄球菌。高峰等[8]認(rèn)為痤瘡是在一定的皮膚環(huán)境內(nèi)多種細(xì)菌相互作用的結(jié)果。隨著痤瘡實(shí)驗(yàn)研究的深入，該模型的制備也將接近于人類痤瘡發(fā)生、發(fā)展規(guī)律。痤瘡的發(fā)病機(jī)制、治療手段、藥物開發(fā)等方面一直是科研工作熱點(diǎn)，但可提供痤瘡研究的動(dòng)物模型少，痤瘡模型制備方法也不斷改進(jìn)。用金黃地鼠的色斑來證實(shí)抗雄激素作用；用痤瘡丙酸桿菌液、表皮葡球菌在兔耳、大鼠進(jìn)行皮下注射，可使動(dòng)物耳部注射處變厚，但痤瘡丙酸桿菌為厭氧菌，在皮膚組織中存活時(shí)間尚未明確；墨西哥狗自發(fā)性痤瘡是當(dāng)前最接近臨床的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，但該模型周期長、成本高，故不利于廣泛開展相關(guān)研究。目前最常用的是Kligman模型，該模型的使用已超過半個(gè)世紀(jì)，1989年美國皮膚病學(xué)會(huì)已制定了使用規(guī)范[9]。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)煤焦油易附著于皮膚，該方法來制備兔耳痤瘡角質(zhì)化模型有效，時(shí)間較短，模型成功率高、經(jīng)濟(jì)，也可用于溶解皮膚角質(zhì)化相關(guān)課題研究。但痤瘡的病機(jī)涉及內(nèi)分泌、菌群感染、飲食習(xí)慣、心理素質(zhì)等方面，都影響?zhàn)畀彽陌l(fā)生、發(fā)展。該模型僅能模擬痤瘡角質(zhì)化的皮膚組織學(xué)改變：兔耳表皮粗糙、角質(zhì)化，顆粒層和組織層增厚，毛囊破損，皮膚結(jié)構(gòu)邊緣模糊，但模型的形成時(shí)間上有個(gè)體差異性，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

[1]蘆源, 田靜, 張慧穎, 等. 消瘡飲對(duì)兔耳微痤瘡模型抑制作用及急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014 (01): 28-29.

[2]魯瑾, 曹煜. 姜黃消痤凝膠對(duì)兔耳粉刺模型的抗角化作用[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志, 2011 (03): 192-195.

[3]趙鴻儒, 趙大華. 中藥消痤霜對(duì)兔耳痤瘡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷母深A(yù)效果[J]. 中國臨床康復(fù), 2006 (07): 108-109.

[4]張學(xué)軍. 皮膚性病學(xué)[M]. 5版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002: 144-145.

[5]Kin J. Review of the innate immune response in acne vulgaris: activation of toll-like receptor 2 in acne triggers inflammatory cytokine responses[J]. Dermatology, 2005, 211(3): 193-198.

[6]Jugean S, Teanud I, Knol AC, et al. Induction of tolllike receptors by propionnic bacterium acne [J]. BR J Dermatol, 2005, 153(6): 1105-1113.

[7]昝文華, 孫劍, 李艷紅, 等. 葡萄球菌菌苗治療痤瘡的實(shí)驗(yàn)報(bào)告[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志, 2000, 14(6): 392-393.

[8]高峰, 胡素泉, 李智華, 等. 176例尋常痤瘡患者馬拉色菌帶菌率的調(diào)查分析[J]. 中華皮膚科雜志,2004,37(8): 492.

[9]劉文彬, 梁慶, 王暉, 等. 外用丹參酮乳膏抗痤瘡藥效及機(jī)制[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012 (14): 212-216.

Preparation of the Acne Model of Rabbits’ Ear

LU Xu1,2, XU Guanghui2, HUANG Yiqi2*
(1. Fujian University of traditional Chinese medicine in Fuzhou,Fujian Province,360122,China; 2. Medical Research Institute in Xiamen City, Fujian Province,361008,China)

ObjectiveTo reconstruct rabbit ear acne by coal tar.Methods9 male rabbits were randomly divided into group A, group B and group C. A group of ear catheter about 2 cm × 2 cm range of saline, B, C coal tar, continuous coating 14 d, to determine whether the model is successful.ResultsThe rabbit ears were thin and white in group B, group B and group C were rough and thickened. The erythema was observed in the same way. There was a small granule uplift and the pores were enlarged. Tissue biopsy: Group A skin tissue structure integrity, B, C group skin tissue hypertrophy, keratinization, skin tissue structure changes.ConclusionThe method of preparing keratinization model of ear acne with corn oil with corn oil is effective.

Acne; Animal model; the Coal-tar; Rabbits’ Ear

2015年度國家海洋公益性項(xiàng)目（201505032）

盧旭（1990—），男，碩士，主要從事方劑療效客觀化及作用機(jī)理研究。

*通訊作者 黃亦琦（1963—），男，主任醫(yī)師，主要從事方劑療效客觀化及作用機(jī)理研究。