肖 珂，王夢(mèng)希，胡勝男，彭國(guó)平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

龍牙百合種球鱗片無(wú)菌快繁技術(shù)研究

肖 珂1，王夢(mèng)希1，胡勝男1，彭國(guó)平2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

以龍牙百合鱗片為材料，對(duì)其組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：百合鱗片組織培養(yǎng)最適表面消毒方法為 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min；最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L；最佳擴(kuò)繁培養(yǎng)基配方為 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；最佳生根培養(yǎng)基配方為 1/2MS+NAA 0.10 mg/L。

龍牙百合；鱗片；消毒滅菌；組織培養(yǎng)

龍牙百合 L.brownii（F.E.Brown ex Mille）var.viridulum Baker是百合的優(yōu)良品種，產(chǎn)量高、品質(zhì)好，因鱗片片形似龍牙而得名，是市場(chǎng)上最受歡迎的百合商品之一。實(shí)際生產(chǎn)中，龍牙百合病害極為嚴(yán)重，常引起大面積、規(guī)模性的死苗，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至無(wú)收[1]。百合病害爆發(fā)的原因主要有 ：（1）百合長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖，病菌通過(guò)種球代代相傳 ；（2）百合同時(shí)受土傳病害、空氣傳播病害、昆蟲傳播病害的危害，病害種類多，侵染嚴(yán)重。筆者通過(guò)組培技術(shù)，去除種球所帶的病原微生物，獲得無(wú)病毒、無(wú)細(xì)菌、無(wú)真菌的種球，以期為龍牙百合安全生產(chǎn)和農(nóng)戶效益提高提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料及試劑 供試材料為新鮮龍牙百合，來(lái)自懷化市中方縣瀘陽(yáng)鎮(zhèn)龍牙百合生產(chǎn)基地，從沙床中取出新鮮龍牙百合，去除部分染病的百合鱗片后洗凈平攤開，待其表面水珠瀝干后備用。供試試劑有無(wú)水乙醇（分析純）、氯化汞（分析純）、84 消毒液、MS 干粉、蔗糖（分析純）、瓊脂粉、6-芐氨基嘌呤（分析純）、萘乙酸（分析純）。

1.1.2 儀器設(shè)備 FA2104N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）、潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、高壓滅菌器（德國(guó) DAIHAN Sdentifi c 有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消 毒 按表1 的方案分別進(jìn)行消毒處理，消毒后百合鱗片用蒸餾水清洗 3 次 ；將鱗片切成 1 cm2左右的小片，接入MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20塊小片（下同）[2]，觀察記錄百合鱗片的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化 為誘導(dǎo)百合鱗片形成愈傷組織，在 MS 培養(yǎng)基中加入 6-BA、2,4-D 兩種激素，為確定誘導(dǎo)百合鱗片的最適激素濃度，設(shè)置6 個(gè)不同濃度梯度（表 2）[3]，觀察記錄培養(yǎng)基中百合鱗片的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 小鱗球增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 在小鱗球增殖培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基）中同時(shí)使用 6-BA、NAA 兩種激素，能較好的促使百合小種球增殖[4-5]。為研究百合小種球鱗莖生長(zhǎng)的最適激素濃度，設(shè)置了5種不同濃度梯度（表 3），觀察記錄培養(yǎng)基中小鱗球的生長(zhǎng)狀態(tài)。

表1 百合鱗片消毒方案

表2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素濃度設(shè)計(jì)

表3 小鱗球的增殖培養(yǎng)基激素濃度

1.2.4 小鱗球生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 在小鱗球增殖培養(yǎng)基中添加激素 NAA，能較好地促使百合小種球生根[4-5]。為研究百合小種球鱗莖生根的最適激素濃度，分別在1/2MS 培 養(yǎng) 基 中 添 加 0.03、0.06、0.10、0.13 和 0.16 mg/L 的 NAA，觀察記錄小鱗球的生根狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒試劑對(duì)百合鱗片組織培養(yǎng)的影響

從表4中可以看出，單獨(dú)使用一種消毒劑消毒，滅菌效果都不理想，處理 1～6 的雜菌感染率都在 40%及以上，且誘導(dǎo)出芽的塊數(shù)較少，僅 10～17個(gè)，這表明氯化汞和84消毒液?jiǎn)为?dú)作為消毒劑時(shí)，控菌能力較差，且在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的處理時(shí)間內(nèi)對(duì)百合鱗片有較大的傷害。而采用 75% 乙醇 + 氯化汞的消毒處理，能有效控制培養(yǎng)過(guò)程中雜菌生長(zhǎng)，處理 7～15的雜菌感染率均不超過(guò) 10%，最低可至 3% ；但是如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)對(duì)百合鱗片造成傷害，如處理 14～15 的發(fā)芽數(shù)顯著低于處理 7～13。綜合考慮，百合鱗片組織培養(yǎng)的最適消毒方法為 ：75% 乙醇擦洗 3min+0.1%氯化汞浸泡 13 min（處理 10），其雜菌感染率為 5%，發(fā)芽率可達(dá) 100%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)構(gòu)

表4 不同消毒處理對(duì)百合鱗片組織培養(yǎng)的影響

2.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 由表5 可知，添加 6-BA 和 2,4-D后愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá) 100%。當(dāng) 6-BA 添加濃度為 0.2 mg/L 時(shí)，愈傷組織數(shù)隨著 2,4-D 濃度的增加而上升 ；而當(dāng) 6-BA 添加濃度為 0.4 mg/L 時(shí)，愈傷組織數(shù)隨著2,4-D 濃度的增加而下降。其中，以 MS+6-BA 0.2 mg/ L+2,4-D 2.0 mg/L 的激素水平，百合鱗片的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá) 100%，且愈傷組織個(gè)數(shù)最多。

表5 不同激素水平下百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)情況的比較

2.2.2 增殖培養(yǎng)基 由表6 可知，5 個(gè)濃度梯度中，以濃度梯度3的百合小鱗球增殖最多，增值率為100%。故增殖培養(yǎng)基中的最適激素濃度為 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

表6 不同激素水平下百合小鱗球增殖情況的比較

2.2.3 生根培養(yǎng)基 由表7 可知，添加 NAA 后，生根率達(dá) 100%。當(dāng) NAA 濃度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的效率都不高，當(dāng) NAA 濃度為 0.10 mg/L 時(shí)，不定根數(shù)量達(dá)到峰值，單株生根數(shù)達(dá) 5.4 根。故生根培養(yǎng)基中 NAA 的最適添加濃度為 0.10 mg/L。

表7 不同激素水平下百合小鱗球生根情況的比較

3 結(jié)論與討論

外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)前，必須經(jīng)過(guò)消毒處理，而消毒試劑的選擇和消毒時(shí)間的控制均會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)。由于外植體結(jié)構(gòu)和屬性不同，各種材料對(duì)消毒試劑都有不同反應(yīng)。例如石云平等[6]以頂芽和葉片為外植體時(shí)，用 10% 漂白粉溶液處理 10 min 進(jìn)行消毒。還有研究，用濃度為 20.0 g/L 的次氯酸鈉溶液浸泡 10 min，滅菌時(shí)不斷搖動(dòng)進(jìn)行外植體消毒。對(duì)百合鱗片來(lái)講，消毒劑的濃度不能過(guò)高，處理時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)。試驗(yàn)分別采用了氯化汞浸泡法、84消毒液浸泡法、乙醇擦洗+氯化汞浸泡法進(jìn)行消毒試驗(yàn)，確定了龍牙百合鱗片組織培養(yǎng)前最適消毒方法為 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min，其雜菌感染率為 5%，發(fā)芽率可達(dá) 100.00%。采用該方法誘導(dǎo)出的愈傷組織不用進(jìn)一步消毒，可直接進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

在龍牙百合的組織培養(yǎng)過(guò)程中，各階段的培養(yǎng)基所用激素水平不同。在實(shí)際生產(chǎn)中，組培苗生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)階段選取最適培養(yǎng)基配方，可以使效益最大化[7]。試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)百合鱗片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。在小鱗球的增殖培養(yǎng)基中同時(shí)使用 6-BA、NAA 2 種激素，能較好地促使百合小鱗球增殖，但要注意2種激素的濃度平衡，如果某種激素濃度過(guò)高會(huì)適得其反，甚至使小鱗球死亡，濃度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致百合小鱗球無(wú)法擴(kuò)增。該試驗(yàn)得出百合小鱗球增殖擴(kuò)繁的最佳培養(yǎng)基配方為MS+ 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L。NAA 是促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但不同植物生根所需的濃度不一致，試驗(yàn)結(jié)果表明百合小鱗球生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為 ：1/2 MS + NAA 0.1 mg/L。

[1]蔣細(xì)旺，司懷軍 . 百合的組織培養(yǎng)技術(shù)綜述 [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，（1）：78-82.

[2]陳世昌，徐明輝 . 植物組織培養(yǎng) [M]. 重慶 ：重慶大學(xué)出版社，2016.

[3]楊柏云，楊慧琴，蔡奇英，等 . 龍牙百合體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及植株再生 [J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版），2005，（6）：536-539.

[4]劉清波，廖兵輝，蔣建雄，等 . 龍牙百合鱗球增重及生根培養(yǎng)研究 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，（4）：375-377.

[5]石云平，楊美純，李 鋒 . 龍牙百合生根·結(jié)鱗莖培養(yǎng)基的優(yōu)化 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（32）：18121-18125.

[6]石 云 平 . 龍 牙 百 合 組 織 培 養(yǎng) 的 優(yōu) 化 研 究 [D]. 廣 西 ：廣 西 大 學(xué)，2008.

[7]金亞征，俞鳳芳，車瑞香，等 . 藥用百合組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究 [J].經(jīng)濟(jì)林研究，2013，31（1）：145-148.

（責(zé)任編輯：成 平）

Rapid Propagation Technology of Aseptic Longya Lilium Bulb Scales

XIAO Ke1，WANG Meng-xi1，HU Sheng-nan1，PENG Guo-ping2
（1. College of Oriental Institute of Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking Longya lilium bulb scales as materials, the key technique of tissue culture were studied. The result showed that the best disinfection method is scrub it with ethanol of 75% then steeped in mercuric chloride of 0.1 percent. When culture the Longya lily, optimize culture medium in each stage, there come to a conclusion that the culture medium of inducing callus of bulb scales is MS + 2,4-D 2mg/L+ 6BA 0.2mg/L, the culture medium of bulb rapid propagation is MS + BA0.5mg/L + NAA 0.5mg/L, the culture medium of take roots is 1/2MS + NAA 0.1mg/L.

Longya lilium; bulb scales; sterilization; tissue culture

Q945.52

A

1006-060X（2017）03-0007-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.003

2016-12-19

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（DFCXY201455）

肖 珂（1996-），女，湖南隆回縣人，本科生，專業(yè)生物技術(shù)。