余 音，廖 瓊，吳智敏，宋海星，官春云，張振華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

NRT1.7 基因突變對(duì)擬南芥硝酸鹽再分配及氮效率的影響

余 音1，廖 瓊1，吳智敏1，宋海星1，官春云2，張振華1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家油料改良中心湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

以 NRT1.7 突變體（nrt1.7-3）和哥倫比亞野生型植株（col.0）為材料，研究 NRT1.7 基因?qū)χ仓戤a(chǎn)量和氮素利用效率（NUE）的影響。結(jié)果表明：在花期、角果期 nrt1.7-3 突變體葉片 SPAD 值顯著升高，出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象；與幼嫩葉片相比，硝酸鹽更多地累積在老葉中；nrt1.7-3植株在花期、收獲期的生物量、產(chǎn)量和氮效率均顯著下降。

擬南芥；NRT1.7 基因；硝酸鹽；氮效率

研究表明，籽粒中 50%～90% 的氮來(lái)自營(yíng)養(yǎng)器官氮素再利用，開(kāi)花后植物體內(nèi)貯存氮的再轉(zhuǎn)運(yùn)是生殖器官獲得氮素的重要途徑，甚至比重新吸收的氮對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)更大[1-2]；而葉片往往在生殖前期會(huì)儲(chǔ)存大量的氮素，因此成為后期氮素再轉(zhuǎn)運(yùn)的重要營(yíng)養(yǎng)器官。

植物體內(nèi)存在低親和（LATS）和高親和（HATS）2 個(gè)硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，分別由 NRT1 和 NRT2 基因家族編碼，調(diào)控著硝酸根離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 NRT1 家族中除了 NRT1.1 具有雙親性外[3]，NRT1.4、NRT1.5、NRT1.6、NRT1.7、NRT1.8、NRT1.9、NRT1.11、NRT1.12 都是低親和轉(zhuǎn)運(yùn)體[4]。其中，NRT1.7 在葉脈中表達(dá)強(qiáng)烈，具有調(diào)節(jié)韌皮部硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[5]。隨著越來(lái)越多與氮代謝有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和基因功能被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與基因的研究或許將成為下一個(gè)提高氮素利用效率（NUE）的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。因此，試驗(yàn)以 NRT1.7 突變體擬南芥和哥倫比亞野生型擬南芥為材料，對(duì)比兩者在花期和收獲期的NUE，并比較衰老葉片和幼嫩葉片的硝酸鹽相對(duì)含量，以探討 NRT1.7 基因?qū)χ仓戤a(chǎn)量和 NUE 的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為哥倫比亞野生型擬南芥植株（col.0）與 NRT1.7 突變型植株（nrt1.7-3）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植株培養(yǎng) 按照 Han 等[6]的方法，選取飽滿的突變體和野生型材料種子，消毒、春化后播種于滅菌后的培養(yǎng)基（蛭石︰珍珠巖 =3︰ 1）上，發(fā)芽一周后移栽至洗凈的珍珠巖基質(zhì)中，采用 10 cm×10 cm×10 cm 的 盒 子在 16 h 光照 /8 h 黑 暗的 溫室 中培 養(yǎng)到 開(kāi)花期和收獲期取樣，室內(nèi)溫度控制在 22±1℃，每盒培育 8 株。植株生長(zhǎng)期間每 5 d 澆灌一次 1/4 Plant Nutrient Solution（ PNS）營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.2 葉 片 SPAD 值 測(cè) 定 用 SPAD-502 Plus 葉 綠 素儀測(cè)定。

1.2.3 葉片硝酸鹽含量取樣與測(cè)定 分別于盛花期（栽培 30 d）和角果期（栽培 42 d），取 8 株蓮座葉混合樣、莖上葉混合樣分別作為老葉、新葉樣品，剪碎后準(zhǔn)確稱取 0.500 g 于 10 mL 離心管中，沸水浴處理 30min，冷卻后定容，采用水楊酸比色法測(cè)定葉片硝酸鹽含量[7]。

1.2.4 植株氮素含量、氮素積累量及氮素利用效率計(jì)算 將成熟期（栽培 56 d）植株分器官取樣，殺青、烘干、粉碎后過(guò) 80 目篩。樣品經(jīng)濃硫酸 -雙氧水消化后采用 Auto Analyzer 3（德國(guó)）連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定[8]。計(jì)算方法 ：

以籽粒產(chǎn)量為基礎(chǔ)的氮素生理效率=籽粒產(chǎn)量÷植株全氮總量

以生物產(chǎn)量為基礎(chǔ)的氮素生理效率=生物產(chǎn)量÷植株全氮總量

氮收獲指數(shù)（NHI）= 籽粒全氮 ÷ 植株全氮總量收獲指數(shù)（HI）= 籽粒產(chǎn)量 ÷ 生物產(chǎn)量

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò) Microsoft Excel 2010和 DPS 7.05 軟件進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRT1.7 基因突變對(duì)擬南芥葉片 SPAD 值影響

無(wú)論在花期還是角果期，擬南芥新葉 SPAD 值均高于老葉?；ㄆ?，突變體老葉 SPAD 值顯著高于野生型植株，新葉差異不顯著（圖1A）；在角果期時(shí)，突變體老葉和新葉 SPAD 值均顯著高于野生型植株，兩者葉片 SPAD 值差異進(jìn)一步擴(kuò)大（圖 1B），葉片出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象。

圖1 突變體和野生型擬南芥不同時(shí)期葉片 SPAD 值的比較（A：花期；B：角果期）

2.2 NRT1.7 基因突變對(duì)擬南芥葉片硝酸鹽含量的影響

硝酸鹽含量的高低一定程度上可以反映出植株氮營(yíng)養(yǎng)水平?；ㄆ冢琧ol.0 植株中新葉硝酸鹽含量顯著高于老葉，但突變體植株老葉硝酸鹽含量顯著高于新葉；與野生型相比，突變體老葉的硝酸鹽含量顯著升高，新葉硝酸鹽含量卻顯著降低（圖 2A）。角果期，col.0植株中新葉硝酸鹽含量顯著高于老葉，但突變體植株老葉硝酸鹽含量顯著高于新葉；突變體老葉硝酸鹽含量顯著高于野生型植株，但新葉之間的差異不顯著（圖2B）。這說(shuō)明無(wú)論在花期還是角果期，突變體植株葉片中硝酸鹽分配發(fā)生改變，大量硝酸鹽累積在老葉。

2.3 NRT1.7 基因突變對(duì)擬南芥干重和15N 再分配比例的影響

由圖3可知，在不同生育期，擬南芥突變體和野生型的總干重存在顯著差異，突變體植株在3個(gè)時(shí)期總干重均顯著小于野生型；隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，植株總干重不斷增加，所以角果期突變體與野生型總干重的差距最小，收獲期兩者差距達(dá)到最大。

圖2 突變體和野生型擬南芥不同時(shí)期葉片硝酸鹽含量的比較（A：花期；B：角果期）

圖3 突變體和野生型擬南芥不同時(shí)期植株總干重的比較

從圖4中可以看出，花期，突變體葉片（新葉＋老葉）和根干重所占比例顯著大于野生型植株；角果期，只有根干重顯著大于野生型植株。3個(gè)時(shí)期莖所占的比例均為最大，角果期所占比例最高（76%～80%）；收獲期由于籽粒和種皮所占比例提高，所以莖占總干重的比例最低（60%～62%）；籽粒干重占收獲期植株總干重的 18.13%～19.43%，種皮干重占15.46%～16.14%。

圖4 突變體和野生型擬南芥不同時(shí)期各器官干重所占比例

由圖5 可知，不同生育期15N 再分配比例有差異。根中15N 的分配比例在花期達(dá)最大值，為 6.75%～6.88%，收獲期最小，為 2.35%～2.47% ；莖中15N 的分配在角果期最大，在收獲期最??；葉片（新葉＋老葉）中15N 的分配在花期最大，角果期最小。與野生型植株相比，突變體花期和角果期的老葉中15N 的再分配比例顯著提高，莖中15N 的再分配比例顯著降低；收獲期，突變體籽粒15N 的再分配比例顯著降低，莖中15N 的再分配比例顯著提高。這說(shuō)明 NRT1.7 基因突變影響擬南芥花期和角果期15N 在老葉和莖中的再分配，導(dǎo)致更少的15N 在收獲期轉(zhuǎn)移到籽粒中。

圖5 突變體和野生型擬南芥不同時(shí)期各器官15N 再分配比例

2.4 NRT1.7 基因突變對(duì)擬南芥氮效率的影響

從表1中可以看出，花期，突變體植株的含氮量顯著高于野生型植株，生物產(chǎn)量和NUE（生物產(chǎn)量/植株全氮）顯著低于野生型植株，由于生物量的濃縮效應(yīng)，導(dǎo)致植株全氮顯著低于野生型植株。

表1 突變體和野生型擬南芥花期生物量及氮效率的比較

由表2可知，收獲期時(shí)，突變體生物產(chǎn)量、籽粒產(chǎn)量均顯著低于野生型植株；植株含氮量和籽粒含氮量卻均顯著高于野生型植株，植株全氮和籽粒全氮間差異不顯著。以生物產(chǎn)量為基礎(chǔ)的氮效率和以籽粒產(chǎn)量為基礎(chǔ)的氮效率均顯著低于野生型植株，植株氮收獲指數(shù)和收獲指數(shù)同樣顯著低于野生型植株。這說(shuō)明NRT1.7 基因突變雖然能提高植株含氮量，但由于生物量顯著降低的濃縮效應(yīng)，植株全氮與野生型的差異并不顯著。此外，NRT1.7 基因突變還導(dǎo)致擬南芥在花期和角果期NUE顯著降低。

表2 突變體和野生型擬南芥收獲期產(chǎn)量及氮效率的比較

3 討 論

作物氮素利用效率（NUE）是作物獲得高產(chǎn)、節(jié)約資源、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障，植株高效再利用氮素是提高 NUE的重要條件。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注植物硝酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程以及代謝過(guò)程有關(guān)基因?qū)?NUE 的影響。NRT1.7 基因?qū)儆谙鯌B(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NRT1家族成員之一，具有調(diào)節(jié)硝酸鹽在葉片轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。Fan 等[5]研究證明 NRT1.7 基因定位在葉片幼嫩的韌皮部中，與葉片硝酸鹽的再轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。研究結(jié)果表明，與野生型植株相比，在花期和角果期，nrt1.7-3 植株老葉 SPAD 值增加，葉片衰老減緩。Han 等[6]的研究表明，NRT1.8 基因可通過(guò)調(diào)控硝酸鹽在地上部和地下部的再分配來(lái)提高油菜的NUE。該試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是花期還是角果期nrt1.7-3 植株衰老葉片中的硝酸鹽分配均顯著高于新葉，這種變化導(dǎo)致植株NUE顯著降低。

綜上所述，擬南芥 NRT1.7 基因突變體植株在花期、角果期、收獲期的生物量顯著低于野生型；硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NRT1.7 基因通過(guò)調(diào)控硝酸鹽在老葉、新葉中的再分配影響植株整體的NUE。因此，該基因可作為今后提高植株NUE的研究方向之一。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Effects of NRT1.7 Gene Mutation on Nitrate Redistribution and NUE of Arabidopsis

YU Yin1，LIAO Qiong1，WU Zhi-min1，SONG Hai-xing1，GUAN Chun-yun2，ZHANG Zhen-hua1
（1. College of Resources and Environmental Sciences, Hunan Agricultural University, Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, PRC; 2 . National Center of Oilseed Crops Improvement, Hunan Branch, Changsha 410128, PRC）

The nrt1.7-3 mutant and wild-type (col 0) were used as materials to study the effects of NRT1.7 on plant yield and NUE of Arabidopsis. The results showed that, compared to wild-type, nrt1.7-3 mutant had increased leaf SPAD value and aggravated blade green in fl owering and pod stage. Compared to the younger leaves, more nitrate was distributed in the old leaves. biomass, plant yield and nitrogen use effi ciency of nrt1.7-3 mutant were signifi cantly reduced in fl owering and harvesting stages.

Arabidopsis; NRT1.7 gene; nitrate; nitrogen effi ciency

Q945.1

A

1006-060X（2017）03-0001-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.001

2017-01-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101596）；湖南省自然科學(xué)基金青年基金（2016JJ3069）；湖南省百人計(jì)劃資助項(xiàng)目；湖南農(nóng)大1515 人才資助項(xiàng)目；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B268）

余 音（1992-），女，湖南保靖縣人，碩士研究生，主要從事植物生理與生態(tài)方向的研究。

張振華