劉洋，劉修恒，王磊，陳志遠(yuǎn)，郭佳，翁小東，杜洋，汪志順，王敏

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

缺血再灌注(I/R)損傷是臨床常見的病理生理變化，常發(fā)生于嚴(yán)重創(chuàng)傷、急性失血、中毒性休克和腎移植術(shù)后[1]。由于腎臟具有高灌注的特性，因此腎臟成為對I/R損傷最敏感的器官之一，發(fā)生I/R后容易導(dǎo)致急性腎功能衰竭和器官移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，腎I/R損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及炎癥反應(yīng)、氧自由基產(chǎn)生、ATP生成減少、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等多個途徑[2]。缺血后處理(IPO)是指在長時間缺血后，組織或器官再重獲多次血流灌注或氧供應(yīng)的過程，可啟動缺血組織和器官的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，進(jìn)而緩解組織和器官的I/R損傷[3]。IPO能抑制腎I/R損傷誘發(fā)的腎組織細(xì)胞凋亡，發(fā)揮很強(qiáng)的腎保護(hù)作用，但機(jī)制尚不明確。芹黃素是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的天然黃酮類化合物，具有顯著的抗癌和抗氧化功能。研究證實，芹黃素對人體多個器官具有保護(hù)作用，能夠有效抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。封莎等[5]研究表明，芹黃素對大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的療效，其機(jī)制可能與阻斷TLR4/NF-κB通路有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，不同干預(yù)措施的聯(lián)合應(yīng)用能夠?qū)ζ鞴買/R損傷產(chǎn)生更好的治療效果[6,7]。但目前，對芹黃素與IPO聯(lián)合處理對腎I/R損傷的治療效果研究尚較少。2016年5～10月，我們采用芹黃素預(yù)處理聯(lián)合IPO，干預(yù)大鼠腎I/R損傷模型，探討二者聯(lián)合處理對腎I/R損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量220～300 g，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心。芹黃素(純度98%)購于上海阿拉丁試劑有限公司；高遷移率族蛋白1(HMGB1)、NF-κB抗體、TNF-α抗體和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)抗體均購于美國Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制備及干預(yù)方法 50只大鼠以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、I/R組、I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組，每組各10只。I/R組、I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組均制備腎I/R模型，暴露兩側(cè)腎臟后，分離腎包膜及腎動靜脈，切除右腎后使用無損傷血管夾夾閉左腎腎動脈和腎靜脈，待腎臟顏色變?yōu)榘导t色即可確定左腎血流被阻斷，45 min后松開動脈夾再灌注，腎臟顏色恢復(fù)為鮮紅色，即認(rèn)為血流恢復(fù)正常，I/R模型制備成功。其中，I/R組于阻斷45 min、再灌注成功后即逐層關(guān)閉腹腔；I/R+芹黃素組在I/R前30 min經(jīng)腹腔注射芹黃素10 mg/kg，然后制備I/R模型；IPO組在制備I/R模型過程中，阻斷左腎動脈血流45 min后，給予反復(fù)3次的恢復(fù)血流10 s、阻斷血流10 s的IPO后，再完全恢復(fù)腎臟血流供應(yīng)；芹黃素+IPO組在制備I/R模型前30 min腹腔注射芹黃素10 mg/kg，阻斷左腎動脈血流45 min后，再給予反復(fù)3次的恢復(fù)血流10 s、阻斷血流10 s的IPO處理。Sham組暴露兩側(cè)腎臟后，僅分離腎包膜及腎動靜脈而不阻斷血流，切除右腎后逐層關(guān)閉腹腔。

1.2.2 血清BUN及Cr水平檢測 各組干預(yù)24 h后，均經(jīng)心臟取血4 mL，置于抗凝管中，37 ℃恒溫靜置4 h，離心分離血清，-70 ℃保存，使用日本Olympus Au2700全自動生化分析儀測定血清BUN及Cr水平。

1.2.3 腎組織病理組織學(xué)觀察 取血后處死各組大鼠，摘取左腎，40 g/L多聚甲醛固定后制備石蠟切片，行HE染色，置于日本Olympus顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4 腎組織HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達(dá)檢測 采用Real time PCR法。TRIzol法提取總RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度。取總RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。HMGB1上游引物5′-GCTGACAAGGCTCGTTATGAA-3′，下游引物5′-CCTTTGATTTTGGGGCGGTA-3′；NF-κB上游引物5′-GCAGCACTACTTCTTGACCACC-3′，下游引物5′-TCTGCTCCTGAGCATTGACGTC-3′；TNF-α上游引物5′-CTTCTCATTCCTGCTCGTGG-3′，下游引物5′-TCCGCTTGGTGGTTTGCTAC-3′；ICAM-1上游引物5′-GGGATGGTGAAGTCTGTCAA-3′，下游引物5′-GGCGGTAATAGGTGTAAATGG-3′；以GAPDH為內(nèi)參照，GAPDH上游引物5′-TCAAGGCTGAGAATGGGAAG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′。PCR反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后一次為72 ℃延伸7 min。最后做融解曲線，檢測 PCR 產(chǎn)物的特異性，對樣品的 mRNA含量進(jìn)行定量分析。

1.2.5 腎組織NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。將保存的腎組織制成4 μm的石蠟切片，使用SP法免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，分別加入NF-κB、TNF-α和ICAM-1抗體及相應(yīng)二抗，DAB顯色、復(fù)染、透明、封固，光鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒沉積為陽性，以PBS代替一抗作為陰性對照。所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。結(jié)果判斷應(yīng)用HPIAS-1000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每張標(biāo)本按順序選15個腎小球視野，分別檢測每個腎小球視野內(nèi)出現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)，最后以每組的均值作為陽性指數(shù)進(jìn)行比較。

1.2.6 腎組織HMGB1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。取腎組織，剪碎后勻漿，加入裂解液提取蛋白，4 ℃ 12 000 r/min離心取上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，100 V電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，稀釋一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶2 000稀釋后加入孵育，洗膜后ECL法顯色并照相。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以HMGB1/GAPDH比值作為HMGB1相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清BUN及Cr水平比較 I/R組、I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組血清BUN及Cr水平均高于Sham組(P均<0.05)；I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組血清BUN及Cr水平均低于I/R組(P均<0.05)；芹黃素+IPO組血清BUN及Cr水平均低于I/R+芹黃素組及IPO組(P均<0.05)。I/R+芹黃素組與IPO組血清BUN及Cr水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。詳見表1。

2.2 各組腎組織病理學(xué)改變 Sham組腎小管排列整齊，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞，腎小管未見明顯的形態(tài)學(xué)改變。I/R組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞明顯變性壞死，界限不清，腎小管明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見細(xì)胞管型。與I/R組相比，芹黃素+IPO組、I/R+芹黃素組和IPO組腎小管損傷程度明顯減輕，有少量腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫、空泡變性，管型少見，有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

表1 各組血清BUN及Cr水平比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；與芹黃素+IPO組比較，△P<0.05。

2.3 各組腎組織HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達(dá)比較 I/R組、I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)均高于Sham組(P均<0.01)；I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)均低于I/R組(P均<0.05)；芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)均低于I/R+芹黃素組及IPO組(P均<0.05)。見表2。

注：A為Sham組；B為I/R組；C為I/R+芹黃素組；D為IPO組；E為芹黃素+IPO組。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)染色結(jié)果(HE染色，×400)

2.4 各組腎組織HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)比較 I/R組、I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)均高于Sham組(P均<0.01)；I/R+芹黃素組、IPO組、芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)均低于I/R組(P均<0.05)；芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)均低于I/R+芹黃素組及IPO組(P均<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組腎組織HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表達(dá)比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.05；與芹黃素+IPO組比較，△P<0.05。

表3 各組HMGB1蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與IR組比較，#P<0.05；與芹黃素+IPO組比較，△P<0.05。

注：1為Sham組；2為I/R組;3為I/R芹黃素組；4為IPO組;5為芹黃素+IPO組。

圖2 各組腎組織HMGB1蛋白表達(dá)情況(Western blot法)

3 討論

腎臟血供豐富、結(jié)構(gòu)特殊，因此對I/R損傷極其敏感。腎I/R損傷常發(fā)生于腎移植和創(chuàng)傷后休克等過程中，極易誘發(fā)急性腎損傷，甚至造成急性腎功能衰竭[8]。腎I/R損傷的預(yù)防和治療已逐漸成為當(dāng)今研究的熱點。腎I/R的治療方法主要包括缺血預(yù)處理、IPO、藥物預(yù)處理、藥物后處理以及聯(lián)合治療等。IPO指組織器官在I/R時一系列間斷、反復(fù)獲得血流灌注的過程[9]。研究表明，IPO能有效減少腎I/R后組織細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與氧自由基和各種炎癥因子的減少、內(nèi)皮素活性降低、NO等保護(hù)性物質(zhì)的產(chǎn)生、I/R損傷補(bǔ)救酶(RISK)途徑被激活等有關(guān)[10, 11]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組血清BUN及Cr水平均高于Sham組，病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞明顯變性壞死，腎小管明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見細(xì)胞管型，提示發(fā)生I/R損傷后腎組織損傷嚴(yán)重；IPO組血清BUN及Cr水平均低于I/R組，腎小管損傷程度明顯減輕，提示IPO能有效地減輕I/R對腎臟組織的損傷，腎功能明顯好轉(zhuǎn)。但是，IPO因操作有創(chuàng)、時機(jī)的選擇、術(shù)后危險性和不可預(yù)知性等原因，其臨床應(yīng)用受到諸多限制。因此，尋找簡單易行安全可靠的干預(yù)措施逐漸成為研究熱點。將IPO與其他方法相結(jié)合，以彌補(bǔ)單一方法對I/R損傷治療效果的不足，這將成為腎I/R損傷治療中的一個新方向。

芹黃素是從植物中提取的天然單體活性成分，屬于多酚類物質(zhì)。研究表明，芹黃素具有抗氧化、抗腫瘤、防止細(xì)胞衰老的作用，并且對心臟、肝臟組織的I/R損傷有一定的療效[12]。張慧芝等[13]研究表明，NF-κB及ICAM-1均參與了心肌I/R損傷過程，而芹菜素能夠抑制NF-κB的活性，降低I/R損傷后炎癥因子ICAM-1的表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制各類炎癥因子的表達(dá)和釋放有關(guān)。然而，芹黃素預(yù)處理存在缺血時間的不確定性，在臨床應(yīng)用上容易產(chǎn)生局限性，IPO雖然具有可控性，但其保護(hù)效果不及聯(lián)合處理。芹黃素預(yù)處理和缺血后處理在治療腎I/R損傷的機(jī)制上具有一定的相似性，兩者的聯(lián)合干預(yù)或許可以發(fā)揮協(xié)同的保護(hù)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R+芹黃素組血清BUN及Cr水平均低于I/R組，腎小管損傷程度較I/R組明顯減輕，提示芹黃素預(yù)處理能夠使I/R損傷大鼠的血清BUN和Cr水平顯著降低，減輕腎功能病理損傷；芹黃素+IPO組血清BUN及Cr水平均低于I/R+芹黃素組及IPO組，腎組織損傷程度明顯減輕，提示芹黃素預(yù)處理聯(lián)合IPO能夠更有效地減輕腎I/R損傷，促進(jìn)腎功能明顯好轉(zhuǎn)。

HMGB1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)、高度保守的非組織核蛋白，是一種強(qiáng)大的致炎細(xì)胞因子，可由免疫細(xì)胞在炎癥因子的刺激下主動分泌，主要參與DNA重組修復(fù)、核小體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)錄等過程，是一種重要的晚期炎性介質(zhì)，參與各種炎癥過程[14]。近年來研究表明，HMGB1參與了心、腦、肝、腎等重要臟器的I/R損傷過程[15]。Chung等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1分泌和釋放可能有助于減輕腎臟I/R損傷。HMGB1與其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)相互作用，激活ERK激酶、P38MAPK激酶和c-Jun激酶，并間接地導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB出現(xiàn)核移位[17]。此外，HMGB1也能夠促進(jìn)TNF-α、ICAM-1和IL-1等炎性介質(zhì)的表達(dá)，引起白細(xì)胞的過度聚集，從而導(dǎo)致炎癥損傷反應(yīng)的加重[18]。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈啟動子κB位點結(jié)合的核因子，存在于各類細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是多種信號傳導(dǎo)通路的常見轉(zhuǎn)錄因子，被激活的NF-κB能夠介導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，如TNF-α、ICAM-1等，并引起多形核白細(xì)胞的聚集黏附，最終導(dǎo)致腎I/R后炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)性腎臟組織損害[19]。腎臟發(fā)生I/R損傷后，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，生成大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，從而激活中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞并表達(dá)ICAM-1。ICAM-1是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附浸潤的最重要因素之一，其高表達(dá)能夠刺激中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，加劇腎臟組織的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)均高于Sham組，提示大鼠腎臟發(fā)生I/R后產(chǎn)生大量的炎癥因子，HMGB1、NF-κB、ICAM-1、TNF-α明顯上調(diào)，導(dǎo)致腎組織出現(xiàn)炎癥損傷反應(yīng)。

封莎等[5]研究表明，芹黃素能夠降低腦I/R模型大鼠血清TNF-α、IL-6水平，抑制Toll樣受體4和NF-κB的表達(dá)，認(rèn)為芹黃素對I/R損傷的保護(hù)機(jī)制可能與抑制TLR4、NF-κB以及炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。研究證實，芹黃素能夠阻斷HMGB1與其受體RAGE的結(jié)合，并抑制NF-κB的激活所導(dǎo)致的促炎作用。因此，芹黃素能夠下調(diào)HMGB1-RAGE-NF-κB的表達(dá)來減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素+I/R組HMGB1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1 mRNA表達(dá)均低于I/R組，提示腎I/R損傷后芹黃素能夠明顯抑制腎組織炎癥反應(yīng)；芹黃素+IPO組HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表達(dá)均低于I/R+芹黃素組及IPO組，提示芹黃素預(yù)處理聯(lián)合IPO的基礎(chǔ)上聯(lián)合的干預(yù)方案，能夠更為有效地抑制腎缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)，比芹黃素預(yù)處理或IPO的單一治療更加安全有效，可能為芹黃素預(yù)處理聯(lián)合IPO能夠減輕腎I/R損傷的機(jī)制之一。