郭建江,張榮標,楊 寧

(1.江蘇大學電氣與信息工程學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.常州工學院電氣與光電工程學院,江蘇 常州 213002)

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面向水產(chǎn)病原菌微流控檢測的磁控分離方法*

郭建江1,2,張榮標1*,楊 寧1

(1.江蘇大學電氣與信息工程學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.常州工學院電氣與光電工程學院,江蘇 常州 213002)

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌是導致水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的主要原因,針對傳統(tǒng)方法存在耗時長、試劑成本高、目標菌難分離及自動化程度低等缺點,開展了面向水產(chǎn)病原菌微流控檢測的磁控分離方法的研究。設(shè)計了磁控捕獲及分離等功能的專用磁場控制器,構(gòu)建了基于微流控芯片的磁控分離實驗平臺,優(yōu)化選擇了磁極電流、磁控頻率及捕獲時間等參數(shù),并以大腸桿菌E.coliO157:H7為例對磁控分離捕獲率進行了實驗驗證,研究結(jié)果表明,磁控分離法捕獲率可達到92%以上,與被動分離捕獲方式相比,不僅捕獲率提高30%,而且分離操作靈活可控,自動化水平較高,實現(xiàn)了水產(chǎn)病原菌的高效分離,也為后續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害快速檢測與預警提供保障。

水產(chǎn)病原菌檢測;微流控芯片;磁控分離;捕獲率

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中由于病原菌(如嗜水氣單胞菌、大腸桿菌等)導致的水產(chǎn)病害常常會造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失,因此如何實現(xiàn)水產(chǎn)病原菌(簡稱病原菌)快速檢測與預警是保證水產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵[1-2]?；谖⒘骺匦酒牟≡鷻z測技術(shù)以其檢測靈敏度高、檢測速度快、試劑量小及易于集成化和自動化等優(yōu)點已成為目前病原菌快速檢測的研究熱點[3-4]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖多采用集約化模式,導致水環(huán)境成分復雜多樣,如何將病原菌目標菌從樣本中快速分離對提高后續(xù)微流控檢測精度尤為關(guān)鍵,常規(guī)的病原菌微分離法有被動式分離[5]、介電電泳法[6]、光學分離等[7]。免疫磁分離法是采用表面偶聯(lián)菌抗體的免疫磁珠(簡稱磁珠)與病原目標菌發(fā)生特異性免疫反應形成菌/磁珠復合物來捕獲目標菌,并通過外磁場作用富集和分離細菌。與上述其他分離法相比,磁分離法具有靶向捕獲率高,操作簡單、速度快及易于保持目標菌活性等優(yōu)點,利于提高后續(xù)檢測精度和速度[8]。Forbes等[9]對在外磁場作用下的T型微通道中免疫磁珠的磁控分離運動進行了理論分析和數(shù)值模擬,分析了流場、磁場和濃度場對磁珠分離效率的影響。Munir等[10]在內(nèi)嵌間歇電磁場控制下的微通道內(nèi)模擬仿真了納米磁珠捕獲和分選生物分子的過程,并與被動式分選相比較,提高了分選效率。Tania Smistrup K等[11]模擬設(shè)計了一種可變磁場結(jié)構(gòu)的磁珠捕獲生物分子的微流控裝置,該裝置隨不同對象可調(diào)整磁場特性取得最佳的捕獲分選效率。Debarun Das等[12]采用外置磁場結(jié)合內(nèi)嵌電泳結(jié)合驅(qū)動的方式模擬仿真免疫磁珠捕獲細胞和病原菌的過程,相比單一驅(qū)動方式,捕獲率大大提高。國內(nèi)上海交通大學的吳信宇[13]等采用多物理場耦合分析法,利用磁場與流場的協(xié)同作用對比研究直通、L型和T型等3種通道提高微通道磁泳分離效率的方法。大連理工的嚴小沖[14]采用流場與磁場耦合分析法數(shù)值仿真了不同流速下磁珠在永磁體吸附下運動軌跡。

上述文獻模擬仿真研究了不同芯片結(jié)構(gòu)下的微流控微納粒子磁分離方法,但對微流磁控分離病原菌等生物分子的機理還需進一步的實驗研究與驗證。本文提出一種基于微流控檢測的水產(chǎn)病原菌磁控分離方法,以常見的水產(chǎn)病原菌大腸桿菌E.coliO157:H7(簡稱大腸桿菌)為例對該方法進行分析和實驗驗證。

1 病原菌微流控磁控分離機理[14-15]

由麥克斯韋全電流定律

(1)

式中:H為磁場強度,L為積分閉合回路,I為電磁線圈電流。

由式(1)可知,磁控分離所設(shè)計的磁場發(fā)生器采用電磁驅(qū)動方式時,磁場的磁場強度與電磁線圈的驅(qū)動電流成正比。

在病原菌磁控分離過程中,磁珠一方面受到外磁場施加的磁場作用力,另一方面受到樣本流體對磁珠的粘滯阻力。其中外磁場對單個磁珠施加磁場作用力為:

Fm=μ0χeffVP(H·)H

(2)

式中:μ0為真空磁導率,Vp為磁珠體積,χeff為磁珠有效磁化系數(shù)。

由式(1)和式(2)可知,當其他參數(shù)不變時,外磁場對磁珠的作用力與磁場強度成正比,即與線圈驅(qū)動電流成正比。樣本流體對單個磁珠的粘滯阻力為:

Fd=-6πηrP(vf-vP)

(3)

式中:η為流體粘度,rp為磁珠半徑,vf為流體速度,vp為磁珠速度。

由牛頓第二定律:

(4)

式中:mp為磁珠質(zhì)量,Fg為單個磁珠受到的重力和浮力之和。

由于磁珠微小,Fg遠小于磁場力和粘滯阻力因而可以忽略,且在微尺度下磁珠的速度變化率近似為0,因此

Fm+Fd=0

(5)

即磁場對磁珠的磁力與流體對磁珠的粘滯阻力相平衡。對樣本流體而言,磁珠對流體的攪動力Fj等于Fd也等于Fm,即磁珠對病原菌的捕獲與分離受磁場力Fm影響。

由層流不可壓縮流體Navier-Stokes方程為:

(6)

式中:ρf為流體密度,P為壓強,c為磁珠濃度,δ(f)為隨磁場頻率f變化的周期函數(shù)。

由式(6)可知磁珠對病原菌的捕獲與分離程度受磁場頻率和磁場力的控制。

定義病原菌磁控捕獲率CE(Capture Efficiency)(以下簡稱捕獲率)

(7)

式中:Cm為磁控分離后細菌濃度,C0為細菌初始濃度。

采用捕獲率來定量評價微流控磁控分離系統(tǒng)的性能優(yōu)劣。

圖1 磁控分離芯片模型圖

2 實驗平臺與實驗方法

2.1 微流控芯片設(shè)計

如圖1所示,所設(shè)計的微流控芯片包括磁控分離室以及進出樣口等結(jié)構(gòu),具備樣品進樣、磁控混合、磁控捕獲及分離目標菌等功能。芯片以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為基材,在PDMS上刻畫出微納通道并粘合在玻璃基片上。芯片微管道體積為6.8×10-3mL。A和B分別為免疫磁珠和大腸桿菌樣本進樣口,C為清洗雜質(zhì)流出口,D為磁控分離后的檢測輸出口。磁控分離室用于磁珠與細菌在外磁場力作用下充分混合并發(fā)生免疫反應,完成細菌的捕獲與分離。磁控分離是基于磁珠的磁致運動實現(xiàn)細菌的富集和分離,因此磁控特性的優(yōu)劣影響磁控分離的效果以及后續(xù)的檢測精度。

2.2 病原菌微流控磁控分離實驗平臺

圖2是磁控分離整體實驗平臺。微流控芯片放置于磁場控制器中心-Z軸鐵芯端子上,微量注射器連接于注射泵(0.098 μm/步,CVs的流量精度<1%),通過芯片通道A、B將病原菌樣本和免疫磁珠溶液(粒徑180 nm,濃度10 mg/mL)注入微流控芯片。芯片A、B通道通過注射泵啟停動作來控制注入磁珠與細菌樣本的流量,通道C、D通過聚四氟乙烯導管夾控制分離后的流體通斷,通道C接清洗雜質(zhì)采集試管,通道D接磁控分離后的樣本采集試管。

1.注射泵;2.微量注射器;3.微流控芯片;4.磁場控制器;5.直流穩(wěn)流電源;6.電源控制板;7.清洗液采集試管圖2 磁控分離實驗平臺照片

磁場發(fā)生器由X-Y-Z軸6個鐵芯線圈驅(qū)動產(chǎn)生正負6個方向的平行磁場,每個方向的磁場在磁控分離室中心處的磁感應強度可在0～65 mT范圍內(nèi)調(diào)控,直流穩(wěn)流電源(YB3205,0-5A)可通過單片機電源控制板控制磁場控制器各個方向的磁極線圈供電,調(diào)節(jié)改變X-Y-Z軸磁場力和磁控頻率控制病原菌磁控分離效率。

2.3 實驗方法

病蟲害防治是冬棗幼果期的一項重要管理內(nèi)容。病害主要防治炭疽病、斑點落葉病、銹病等，蟲害主要防治盲蝽蟓、紅蜘蛛、桃小食心蟲等。

通常水產(chǎn)養(yǎng)殖集約養(yǎng)殖水環(huán)境中單位體積中病原菌含量較低,因此需采用濾膜(<0.45 μm)真空泵富集并定量沖洗稀釋后得到病原菌檢測樣本。常用的標準檢測方法為平板計數(shù)法。即取定量樣本分布于特異性顯色培養(yǎng)基上,并將其放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃,200 r/min)中48 h增菌培養(yǎng),之后根據(jù)顯色菌落計數(shù)方法得檢測樣本病原菌濃度。

本實驗方法將大腸桿菌作為目標病原菌,志賀氏菌和金黃色葡萄球菌為捕獲干擾菌,所用采用菌種由江蘇大學食品工程學院實驗室提供。將三類菌種分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)配成病原菌溶液,梯度稀釋后采用平板計數(shù)法測得3種細菌的系列濃度標準樣本。為驗證磁控分離效果,將大腸桿菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌三類病原菌樣本按照1∶4∶5比例調(diào)配成水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌合成樣本。

驅(qū)動磁場發(fā)生器X-Y平面的4個磁極循環(huán)間歇通斷給芯片的磁控分離室施加平行磁場,實現(xiàn)樣本與磁珠進行磁控混合并發(fā)生免疫反應生成磁珠/細菌復合物(如圖1所示),定時磁控分離后,啟動Z向磁極將磁珠/細菌復合物吸附在分離室下部,將B口換成PBS緩沖液注射沖洗分離室,然后停止Z向磁極釋放磁珠/細菌復合物實現(xiàn)病原菌從樣本中分離,取D口輸出試管樣本進行平板菌落計數(shù),獲得該磁控分離條件下病原菌濃度與初始病原菌濃度的比例關(guān)系由式(7)計算病原菌磁控捕獲率。

實驗首先測定優(yōu)化磁控分離系統(tǒng)主要參數(shù)及其條件,而后依據(jù)最優(yōu)檢測條件對系列濃度的病原目標菌樣本進行磁控捕獲率檢測與驗證,并與被動式混合分離方法進行比較,驗證與評價該磁控分離系統(tǒng)性能好壞。

3 結(jié)果與討論

3.1 主要參數(shù)測定與優(yōu)化

由上述磁控分離機理可知,病原菌微流控磁控分離系統(tǒng)中的磁控電流、磁控頻率及捕獲時間等參數(shù)直接影響分離的效率。因此本實驗取病原菌合成樣本(1 mL,大腸桿菌濃度2.6×103CFU/mL)與磁珠溶液(1 mL)由注射泵驅(qū)動微量注射器同時注入微流控芯片,并分別測定不同參數(shù)下的系統(tǒng)磁控捕獲率,從而確定最佳檢測效果下的系統(tǒng)參數(shù)與條件。

3.1.1 磁控電流

如圖3所示,實驗結(jié)果顯示當磁控電流小于3 A時,檢測樣本的磁控捕獲率呈線性上升,但大于3 A后無明顯改變,表明磁場對磁珠控制達到飽和,此時磁珠受到的磁控力最大,對細菌的捕獲效率最佳。因此可確定系統(tǒng)最佳磁控電流為3 A。

圖3 磁控捕獲率隨磁控電流的變化

3.1.2 磁控頻率

由式(6)可知,磁場變化頻率影響樣本流體的流動,即影響磁珠與病原菌的免疫反應,從而影響到磁控捕獲率,當磁控頻率過低時,磁場力的擾動過慢,磁控捕獲率不高,捕獲率隨著磁場力頻率的增加而增加。但當頻率過高時,磁珠受到液體粘滯阻力作用而滯后于磁場力的擾動,同時,磁珠受到變化過快的磁場力而不能得到充分的釋放,因而磁場隨著磁場力頻率的進一步增加反而會導致磁控捕獲率下降。

實驗中采用0.5Hz～6Hz等范圍的7種不同磁控頻率參數(shù)對檢測樣本進行磁控捕獲率檢測,結(jié)果如圖4所示,小于4Hz時,磁控捕獲率呈類似線性增加,直到大于4Hz時捕獲率開始明顯下降,說明此時病原菌磁控捕獲率最大,因此可確定系統(tǒng)最佳磁控頻率為4Hz。

圖4 磁控捕獲率隨磁控頻率的變化

3.1.3 目標菌磁控捕獲時間

在微芯片通道中磁珠捕獲目標菌發(fā)生免疫反應時間直接影響磁控捕獲率的高低。時間過短會造成免疫反應不充分導致捕獲不完全;時間過長會由于磁珠頻繁碰撞導致部分反應復合物的磁珠與菌分解引起捕獲率誤差。因此在上述優(yōu)化磁控電流和頻率的條件下,實驗分別取1min～7min的捕獲時間進行系統(tǒng)捕獲率檢測。如圖5所示,當捕獲時間等于5min時,捕獲率達到最大,而且超過5min后捕獲率有下降趨勢,因此結(jié)果表明此時磁控捕獲率誤差最小。

圖5 磁控捕獲率隨目標菌捕獲時間的變化

3.2 系統(tǒng)性能分析

采用上述實驗測定的系統(tǒng)最優(yōu)參數(shù)針對不同濃度的目標檢測樣本進行磁控分離效果分析。取以定量大腸桿菌作為目標菌(1mL濃度為3×108CFU/mL)樣本施加不同濃度的2種干擾菌充分混合并梯度稀釋后,生成不同濃度的7種目標菌檢測樣本,與定量磁珠溶液(1mL)同時注入微流控芯片,采用最佳參數(shù)條件磁控分離檢測,將不同條件下磁控捕獲率與樣本中目標菌濃度作定量關(guān)系。如圖6所示。結(jié)果表明樣本目標菌濃度在3×102CFU/mL～3×108CFU/mL范圍內(nèi),磁珠對目標菌的捕獲效率均在92%以上,當目標菌濃度大于3×106CFU/mL時,系統(tǒng)磁控捕獲率低于90%,因此本文提出磁控分離方法對高濃度(106CFU/mL)和低濃度(102CFU/mL)的細菌都具有較高的捕獲效率。

圖6 不同濃度大腸桿菌樣本的磁控捕獲率

圖7 不同分離方式病原菌捕獲率比較

為進一步驗證分析所提出的磁控分離系統(tǒng)的性能,取6組系列梯度濃度(4×102CFU/mL～4×107CFU/mL)范圍內(nèi)的大腸桿菌樣本,施加干擾菌后注入系統(tǒng)進行磁控分離捕獲率檢測驗證,并采用文獻[16]中微流控芯片進行病原菌被動分離比較分析。圖7為2種方法進行大腸桿菌捕獲率所得的比較柱狀圖。從圖7可以看出,本文提出的磁控分離方法與被動分離法相比,目標菌捕獲率提高約為30%,實現(xiàn)了水產(chǎn)病原菌高效分離,有利于提高后續(xù)病原菌檢測精度和檢測效率。

4 結(jié)論

在自行研制的三維可控磁場作用下將水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的磁控混合、捕獲及分離等功能集成于一體創(chuàng)建了微流控磁控分離系統(tǒng),并測定與優(yōu)化了系統(tǒng)的磁控電流、磁控頻率等主要條件參數(shù),與被動式捕獲分離方式相比,捕獲率提高了30%,且提高了病原菌分離自動化水平,實現(xiàn)了水產(chǎn)致病菌的快速高效分離,為后續(xù)病原菌高精度檢測打下基礎(chǔ),所提出的方法為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害快速檢測與預警提供了應用前景。

[1] Adams A,Thompson K D. Development of Diagnostics for Aquaculture:Challenges and Opportunities[J]. Aquaculture Research,2011,42(s1):93-102.

[2] 吳淑勤,王亞軍. 我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害控制技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J]. 中國水產(chǎn),2010(8):9-10.

[3] Hol F J H,Dekker C. Zooming in to See the Bigger Picture:Microfluidic and Nanofabrication Tools to Study Bacteria[J]. Science,2014,346(6208):1251821.

[4] Foudeh A M,Didar T F,Veres T,et al. Microfluidic Designs and Techniques Using Lab-on-a-Chip Devices for Pathogen Detection for Point-of-Care Diagnostics[J]. Lab on a Chip,2012,12(18):3249-3266.

[5] Huang L R. Continuous Particle Separation Through Deterministic Lateral Displacement[J]. Science,2004,304:987-990.

[6] 方明,樊磊,曾一笑,等. 集成陣列叉指電極介電泳芯片粒子分離[J]. 微納電子技術(shù),2016,53(7):461-466.

[7] 耿照新,邢冰冰. 微納流體樣品片上分離技術(shù)[J]. 中國科學:信息科學,2014,44(2):177-198.

[8] Van Reenen A,de Jong A M,den Toonder J M J,et al. Integrated Lab-on-Chip Biosensing Systems Based on Magnetic Particle Actuation—A Comprehensive Review[J]. Lab on a Chip,2014,14(12):1966-1986.

[9] Forbes T P,Munson M S,Forry S P. Theoretical Analysis of a Magnetophoresis-Diffusion T-Sensor Immunoassay[J]. Lab on a Chip,2013,13(19):3935-3944.

[10] Munir A,Zhu Z,Wang J,et al. FEM Analysis of Magnetic Agitation for Tagging Biomolecules with Magnetic Nanoparticles in a Microfluidic System[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2014,197:1-12.

[11] Smistrup K,Bu M,Wolff A,et al. Theoretical Analysis of a New,Efficient Microfluidic Magnetic Bead Separator Based on Magnetic Structures on Multiple Length Scales[J]. Microfluidics and Nanofluidics,2008,4(6):565-573.

[12] Das D,Al-Rjoub M F,Banerjee R K. Enhanced Capture of Magnetic Microbeads Using Combination of Reduced Magnetic Field Strength and Sequentially Switched Electroosmotic Flow—A Numerical Study[J]. Journal of Biomechanical Engineering,2015,137(5):051008.

[13] 吳信宇. 磁動力微流控芯片內(nèi)磁珠動力學行為及其強化混合與分離機理研究[D]. 上海交通大學,2012.

[14] 嚴小沖. 微流控芯片中磁珠吸附機制研究[D]. 大連理工大學,2013.

[15] Yang R J,Hou H H,Wang Y N,et al. Micro-Magnetofluidics in Microfluidic Systems:A Review[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2016,224:1-15.

[16] 郭建江,張榮標,楊寧,等. 基于微流控芯片的圓褐固氮菌濃度快速檢測方法[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報,2015,46(1):155-159.

郭建江(1970-),湖北襄陽人,江蘇大學在讀博士,現(xiàn)為常州工學院教授,研究方向為微流控檢測技術(shù)在農(nóng)業(yè)自動化中的應用;

張榮標(1957-),江蘇南通人,現(xiàn)為江蘇大學電氣信息工程學院教授,博士生導師,研究方向為計算機智能檢測技術(shù),474820848@qq.com。

Magnetic Isolating Method for Aquaculture Pathogens Detection System*

GUOJianjiang1,2,ZHANGRongbiao1*,YANGNing1

(1.School of Electrical and Information Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212013,China;2.School of Electrical and Photoelectronic Engineering,Changzhou Institute of Technology,Changzhou Jiangsu 213002,China)

Pathogenic bacteria in aquatic environment is the major cause of aquaculture diseases. However conventional methods require a long time and a great amount of cost for other reagents,and suffer from difficult isolation and lower automation. A magnetic isolating method for aquaculture pathogens detection system was proposed. A dedicated magnetic controller with magnetic capture and isolation was designed,and the magnetic isolation experiment platform based on microfluidic chip was built up. The optimum magnetic pole current,switching frequency and capture time of the platform were determined,and illustrated by the case ofEscherichiacoliO157:H7 the performance of the method was experimentally verified. The research results showed that the capture efficiency of magnetic isolating method reached as high as 92%. And compared with passive isolation by barriers,the capture efficiency increased by 30%,and the separating operation was flexible and controllable with higher automation,which realized pathogens efficient separation and benefitted rapid detection and early warning on aquaculture disease.

aquaculture pathogens detection;microfluidic chip;magnetic isolation;capture efficiency

項目來源:中國博士后科學基金資助項目(2014M560404);江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新計劃項目(CX(14)2092);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃資助項目(CXLX12_0662);常州市科技支撐計劃(社會發(fā)展)項目(CE20155054);國家自然科學基金項目(61673195);國家級大學生創(chuàng)新訓練項目(201611055004)

2016-08-11 修改日期:2016-11-07

S943

A

1004-1699(2017)03-0373-05

C:2575;3120

10.3969/j.issn.1004-1699.2017.03.007