陶 陶，沈 洲，項 平，黃 濤，陳恕求，宣 強，肖 峻

HK2基因在前列腺癌中的表達(dá)及其對前列腺癌細(xì)胞惡性表型的影響

陶 陶1，沈 洲1，項 平1，黃 濤1，陳恕求2，宣 強1，肖 峻1

目的 探討HK2基因在前列腺癌中的表達(dá)及其對前列腺癌細(xì)胞惡性表型的影響。方法 利用基因芯片數(shù)據(jù)庫和免疫組化法檢測HK2基因在前列腺癌組織中的表達(dá)。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)敲低HK2表達(dá)后，采用細(xì)胞糖代謝試劑盒、CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測前列腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解、增殖和凋亡能力的改變。結(jié)果 HK2基因的表達(dá)水平隨著前列腺癌的進(jìn)展顯著上升；抑制HK2基因表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖能力顯著降低，細(xì)胞的早期凋亡明顯增加。結(jié)論 HK2基因在前列腺癌的惡性進(jìn)展中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和糖代謝，抑制細(xì)胞早期凋亡；其潛在分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

前列腺腫瘤；己糖激酶2；糖代謝；增殖；凋亡

近年來，腫瘤能量代謝方式的改變受到研究人員越來越多的關(guān)注。2000年Hanahan與Weinberg在《Cell》上發(fā)表了題為“Hallmarks of Cancer: the Next Generation”的綜述，將腫瘤的六大特征擴(kuò)展至十項[1]。其中能量代謝方式的改變，被列為新提出的腫瘤四大特征之一。正常細(xì)胞在有氧條件下將葡萄糖經(jīng)三羧酸循環(huán)徹底氧化生成水和二氧化碳；在缺氧條件下則進(jìn)行無氧糖酵解生成乳酸。與之不同的是，腫瘤細(xì)胞在上述兩種條件下均表現(xiàn)為活躍的葡萄糖攝取和糖酵解，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等糖酵解中間產(chǎn)物是生物大分子合成的主要來源，因此腫瘤細(xì)胞糖酵解的意義在于提供生物大分子合成所需的原料，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，同時幫助腫瘤細(xì)胞耐受外部不穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[2]。本文實驗關(guān)注細(xì)胞糖酵解過程中的第一個限速酶己糖激酶2型(Hexokinase Ⅱ, HK2)基因在前列腺癌中的表達(dá)及其在前列腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 前列腺癌組織標(biāo)本及前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng) 前列腺增生、激素依賴性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)下載于GEO35988數(shù)據(jù)庫[3]；前列腺癌及正常前列腺組織標(biāo)本取自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理組織庫；其中25例前列腺癌組織(病理證實為前列腺腺泡細(xì)胞癌，Gleason評分>7分)和15例癌旁正常前列腺組織用于免疫組化檢測；PC-3細(xì)胞系用含有10%胎牛血清(Gibco公司)，2 mmol/L谷氨酰胺(Glu)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)培養(yǎng)，細(xì)胞常規(guī)置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3天更換1次培養(yǎng)液。PC-3細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 shRNA干擾序列 HK2-shRNA由上海吉瑪公司設(shè)計并構(gòu)建。HK2 shRNA序列：5′-GACCCTCTACAAGCTACAT-3′，陰性對照(NC)shRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和HK2 shRNA混合到Opti-MEMI中，得到轉(zhuǎn)染混合液。孵育15 min后更換6孔板中的培養(yǎng)基為轉(zhuǎn)染混合液，更換前用PBS潤洗2～3遍。之后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.3 免疫組化 石蠟切片脫蠟脫水，置于3%H2O2溶液中室溫孵育30 min，置于抗原修復(fù)液中微波修復(fù)，血清封片，滴加稀釋好的HK2一抗(1 ∶500稀釋，美國Abcam公司)，置于濕盒內(nèi)，4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育，PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。光鏡下檢測并評價顯色結(jié)果。按陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，6%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分。按顯色程度評分：無陽性染色為0分，棕色較弱為1分，中度棕色為2分，棕色較深為3分。將兩項得分結(jié)果相加：0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為()，6分為()。

1.4 熒光定量PCR實驗 轉(zhuǎn)染HK2-shRNA 48 h后Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計檢測濃度，按試劑盒的操作說明行MMLV酶逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測，以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。HK2引物序列：F 5′-ATCCCTGAGGACATCATGCGA-3′，R 5′-CTTATCCATGAAGTTAGCCAGGCA-3′；β-actin引物序列：F 5′-AAGACCTGTACGCCAACACAGT-3′，R 5′-AGAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。

1.5 CCK-8實驗 轉(zhuǎn)染HK2-shRNA 12 h后用于胰酶消化，通過血球計數(shù)板計數(shù)后，以每孔2 000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)。分別于24 h、48 h、72 h和96 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.6 糖酵解檢測實驗 轉(zhuǎn)染HK2-shRNA 12 h后用胰酶消化，將PC-3細(xì)胞均勻接種于24孔板中(每孔100 000個細(xì)胞)，每孔加培養(yǎng)基200 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱以37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清液培養(yǎng)基，按照BiVision乳酸分析試劑盒說明，測量OD值。用胰酶消化細(xì)胞后計數(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各組等量細(xì)胞所產(chǎn)生的乳酸量。

1.7 細(xì)胞凋亡實驗 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，用400 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度約為1×106個每毫升，在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育15 min，加入10 μL PI后輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，每組實驗重復(fù)3次。病理組織中HK2的陽性率比較采用χ2檢驗，細(xì)胞實驗中組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中HK2基因的表達(dá) 通過對GE035988芯片數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，與前列腺增生組織(n=28)相比，HK2基因在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著上升；且在去勢抵抗性前列腺癌組織中(n=35)的HK2基因表達(dá)顯著高于激素依賴性前列腺癌組織(n=59)(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，HK2蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)(60%，15/25)明顯高于正常前列腺組織(20%，3/15)(圖2)。

圖1 HK2基因在前列腺癌GEO35988數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)

BPH.前列腺增生組織；ADPC.激素依賴性前列腺癌；CRPC.去勢抵抗性前列腺癌；***P<0.01

圖2 HK2蛋白在正常前列腺組織(A)和前列腺癌組織(B)(腺泡細(xì)胞癌，Gleason>7分)中的表達(dá)，SP法

2.2 轉(zhuǎn)染HK2-shRNA后HK2的表達(dá)水平變化 HK2-shRNA(sh-HK2)轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞PC-3后，通過熒光定量PCR和Western blot實驗驗證，相對于NC組，實驗組的HK2在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖3)。

2.3 sh-HK2抑制前列腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解能力 在前列腺癌細(xì)胞PC-3中轉(zhuǎn)染sh-HK2，利用Bivision乳酸探針試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量。與NC組相比，sh-HK2組的乳酸產(chǎn)生量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染sh-HK2質(zhì)粒敲低HK2的表達(dá)

A.運用熒光定量PCR檢測sh-HK2處理后細(xì)胞中HK2 mRNA的表達(dá)，**P<0.01；B. Western blot法檢測sh-HK2處理后細(xì)胞中HK2蛋白的表達(dá)

圖4 BiVision乳酸探針試劑盒檢測轉(zhuǎn)染sh-HK2后72 h細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量 **P<0.01

2.4 HK2-shRNA抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力 在前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-HK2，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力變化。sh-HK2轉(zhuǎn)染組PC-3細(xì)胞從種板后48 h開始吸光度數(shù)值下降(P<0.05)，并隨著時間的推移差異趨勢逐漸擴(kuò)大(P<0.05，圖5)。由此說明，敲低HK2表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖能力受到顯著抑制。

2.5 轉(zhuǎn)染sh-HK2后前列腺癌細(xì)胞凋亡增加 在轉(zhuǎn)染sh-HK2 48 h后，AnnexinV FITC/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡。sh-HK2組細(xì)胞凋亡顯著增加，達(dá)(6.71±0.66)%，明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖6)。表明轉(zhuǎn)染sh-HK2后前列腺癌細(xì)胞凋亡增加。

3 討論

圖5 CCK-8法檢測sh-HK2處理細(xì)胞后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況 *P<0.05，**P<0.01

圖6 轉(zhuǎn)染sh-HK2 48 h后AnnexinV FITC/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞早期凋亡水平的改變

目前，根治性前列腺癌切除術(shù)和放療是治愈局限性前列腺癌的主要治療手段。而對于轉(zhuǎn)移性前列腺癌、局部進(jìn)展前列腺癌無法行根治性切除或放療的患者，通常采用雄激素剝奪治療來延緩腫瘤的進(jìn)展，但經(jīng)過14～30個月的中位時間后，幾乎所有患者的病變均將逐漸發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌[4]。且CRPC變得難以控制并且更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，已成為晚期前列腺癌患者死亡的主要原因，中位生存時間小于20個月，目前仍缺乏更為有效的治療方法，多烯紫杉醇作為最有效的化療藥物，也僅能延長患者的總生存期2～2.5個月[5]。最新研發(fā)的靶向前列腺癌雄激素受體(AR)的藥物恩雜魯胺雖然可以在一段時間內(nèi)抑制腫瘤的生長，但隨著腫瘤細(xì)胞AR的擴(kuò)增、突變、剪切體形成及潛在的分子信號旁路的激活而療效逐漸減弱。新近研究發(fā)現(xiàn)，恩雜魯胺在抑制腫瘤生長的同時，卻激活了腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路。由此可見，目前人們對于前列腺癌的惡性表型、進(jìn)展機(jī)制、分子靶標(biāo)及有效的治療手段依舊知之甚少[6]。深入研究去勢抵抗性前列腺癌的形成及進(jìn)展機(jī)制，找到有效的治療去勢抵抗性前列腺癌的關(guān)鍵分子靶標(biāo)仍是今后一個階段研究的重點和難點[7]。

物質(zhì)和能量代謝是生命活動的基本特征之一。人體日常生命活動所需要的能量主要來自葡萄糖的分解代謝所提供。在常氧環(huán)境下，葡萄糖通過糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)徹底氧化分解成H2O和CO2；在缺氧條件下，葡萄糖經(jīng)糖酵解生成乳酸，乳酸又可通過乳酸循環(huán)轉(zhuǎn)變成肝糖原或血糖。這兩種代謝途徑均可為細(xì)胞提供相應(yīng)的能量，但葡萄糖經(jīng)過TCA生成ATP的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糖酵解。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞需要更多的能量和大分子原料以維持其無限快速增殖的特性。糖酵解代謝不但為腫瘤細(xì)胞的生長提供能量，而且為腫瘤細(xì)胞在快速增殖過程中合成重要的生物大分子提供原材料。這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)[2,8]。糖酵解過程主要包括兩個階段，即葡萄糖分解為丙酮酸和丙酮酸還原為乳酸。細(xì)胞液是所有糖酵解酶促反應(yīng)進(jìn)行的部位。糖酵解過程包含己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶-1(PF1)和丙酮酸激酶(PK)三個關(guān)鍵酶，其余的催化酶雖不是關(guān)鍵酶，但也起著至關(guān)重要的作用。HK是調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解的第一個關(guān)鍵酶。Warburg[9-10]研究細(xì)胞糖代謝時發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞HK催化活性增高。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中，HK1和HK2均呈現(xiàn)出高表達(dá)，并且以HK2與腫瘤相關(guān)性最密切[11-12]。HK2在腫瘤細(xì)胞中常高表達(dá)并能夠與線粒體外膜結(jié)合。由此，HK2能夠直接優(yōu)先利用線粒體合成的ATP，完成糖酵解第一步，使得進(jìn)入糖酵解葡萄糖量增加。研究表明，HK2在腫瘤細(xì)胞中具有促進(jìn)增殖和抗凋亡的雙重特性，在腫瘤的惡化進(jìn)程中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活起到重要作用。GPI在糖酵解反應(yīng)中能夠催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖。目前人們發(fā)現(xiàn)，GPI不僅可以促進(jìn)腫瘤的增殖，也能夠活化基質(zhì)金屬蛋白酶從而增強腫瘤的遷移能力。LDHA在調(diào)節(jié)糖酵解最后一步中起著關(guān)鍵作用，能夠催化丙酮酸還原成乳酸，并消耗NADPH。研究發(fā)現(xiàn)，LDHA主要表達(dá)于腫瘤之中，并作為淋巴瘤、前列腺癌、腎癌和黑色素瘤等多種惡性腫瘤的生物標(biāo)志物[13-16]。在本組實驗中，作者首選利用GEO35988數(shù)據(jù)庫分析HK2基因在前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展過程中的表達(dá)趨勢，結(jié)果表明HK2在前列腺癌中的表達(dá)水平顯著高于前列腺增生組織，且在去勢抵抗性前列腺癌中的表達(dá)水平顯著高于激素依賴性前列腺癌。進(jìn)一步，本實驗用免疫組化法驗證了HK2在前列腺癌組織中表達(dá)明顯高于正常前列腺組織。體外實驗證明，抑制HK2的表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞的增殖和有氧糖酵解能力受到明顯抑制；細(xì)胞的早期凋亡率顯著上升。由此提示，HK2基因在前列腺癌的發(fā)生及惡性進(jìn)展中起著重要的作用，可作為前列腺癌分子診斷和治療的潛在靶點之一。

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Expression of HK2 in prostate cancer and its effect on malignant phenotype of prostate cancer cells

TAO Tao1, SHEN Zhou1, XIANG Ping1, HUANG Tao1, CHEN Shu-qiu2, XUAN Qiang1, XIAO Jun1

(1DepartmentofUrology,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China;2DepartmentofUrology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Purpose To study the expression of HK2 in human prostate cancer (PCa) tissues and its effect on malignant phenotype of prostate cancer cells. Methods HK2 expression in PCa tissues was determined by microarray database and immunohistochemical staining. Subsequently, the change of cellular phenotype was detected by glycometabolism kit, CCK-8 kit, and flow cytometry after HK2 knockdown. Results HK2 expression was elevated followed by prostate cancer development. HK2 depletion inhibited cellular proliferation and aerobic glycolysis, and increased the ratio of early apoptosis. Conclusion HK2 expression increases in the process of PCa malignant progression. It plays a critical role in cellular proliferation, glycometabolism, and apoptosis, the mechanism of which needs further exploration.

prostate neoplasms; HK2; glucose metabolism; proliferation; apoptosis

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.016.html

安徽省自然科學(xué)基金(1708085QH202、1608085MH166)

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院泌尿外科，合肥 2300012東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科，南京 210009

陶 陶，男，博士，醫(yī)師。E-mail: taotao860721@126.com 肖 峻，男，博士，副教授，通訊作者。E-mail: xjdoctor@126.com

R 737.25

A

1001-7399(2017)02-0149-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.007

接受日期：2016-12-20