蘇 堅(jiān)，趙曉紅，劉 芳，夏 紅，蘇 波，凌 暉，曾 希，蘇 琦

RORα高表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

蘇 堅(jiān)1,2，趙曉紅2,3，劉 芳2，夏 紅2，蘇 波2，凌 暉2，曾 希2，蘇 琦2

目的 在構(gòu)建RORα高表達(dá)人胃癌MGC803細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影響。方法 采用相差顯微鏡觀察RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞形態(tài)的影響。RT-PCR、Western blot、免疫熒光與免疫組化法檢測(cè)EMT相關(guān)分子表達(dá)。裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RORα高表達(dá)對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果 相差顯微鏡顯示，RORα高表達(dá)細(xì)胞較MGC803細(xì)胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性降低。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)可明顯下調(diào)MGC803細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)(P<0.05)。RT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)可下調(diào)vimentin和上調(diào)E-cadherin mRNA與蛋白表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)組細(xì)胞Snail與vimentin陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱，而E-cadherin陽(yáng)性信號(hào)顯著增強(qiáng)。RORα高表達(dá)組移植瘤較對(duì)照組生長(zhǎng)減慢(P<0.05)，移植瘤體重較對(duì)照組明顯降低，抑瘤率為26.55%(P<0.05)。RORα高表達(dá)組較對(duì)照組癌細(xì)胞異型性降低。RORα高表達(dá)組較對(duì)照組的Ki-67、CD34與vimentin陽(yáng)性表達(dá)均明顯降低，而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論 RORα高表達(dá)可體內(nèi)外抑制人胃癌細(xì)胞EMT。

胃腫瘤；RORα；人胃癌MGC803細(xì)胞；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

我國(guó)胃癌發(fā)生率與病死率位居所有惡性腫瘤的第2位。多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，5年生存率低于10%[1,2]。因此，研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找靶點(diǎn)具有重要意義。維甲酸相關(guān)孤核受體α(retinoid acid receptor related orphan receptor α, RORα)是核受體超家族成員之一，可調(diào)節(jié)多種正常組織細(xì)胞的發(fā)育和分化、生物代謝、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持及高級(jí)神經(jīng)功能等。并且，RORα在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，可能是腫瘤治療的靶點(diǎn)[3,4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RORα在胃癌中低表達(dá)，與胃癌發(fā)生和分化程度有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討RORα高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌MGC803細(xì)胞由湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，RORα高表達(dá)RORα/MGC803細(xì)胞與空載體vector/MGC803細(xì)胞也由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[6]，分別置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與BCA蛋白定量試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；RORα、E-cadherin、vimentin與β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；Snail、Ki-67與CD34抗體與ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司。引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。羊抗兔IgG-HR和羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)于凱基生物；羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)于Protech生物公司。DAPI和正常山羊血清購(gòu)于博士德生物公司。MaxVision試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 相差顯微鏡觀察 MGC803細(xì)胞與RORα高表達(dá)MGC803細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 RT-PCR Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，AMV酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)并合成PCR引物序列：vimentin：F 5′-ACACCCTGCAATCTTTCA GACA-3′，R 5′-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度635 bp；E-cadherin：F 5′-CTCCCAATACA TCTCCCTTCAC-3′，R 5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAGTAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度423 bp；β-actin：F 5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，R 5′-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度498 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，各基因Tm退火45 s 72 ℃延伸80 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，通過(guò)IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值，相對(duì)值以目的基因與β-actin灰度值之比表示。

1.5 Western blot 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期的MGC803細(xì)胞制成懸液，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞融合至80%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基。取出蓋玻片，PBS洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，常溫下靜置15 min，PBS洗5 min×3次；0.5%Triton覆蓋細(xì)胞后，常溫下靜置30 min，PBS洗5 min×3次，吸干凈殘存PBS液；山羊血清封閉，37 ℃孵育1 h；吸凈封閉液，加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜；第2天移置37 ℃復(fù)溫1 h，PBS洗5 min×3次；暗室中加FITC的二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次。染核：將0.4 μg/μL的DAPI覆蓋細(xì)胞，常溫下避光靜置2～5 min，PBS洗5 min×3次，甘油封片在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，4周齡雄性，分為MGC803細(xì)胞組與RORα高表達(dá)組，每組5只。將各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度調(diào)至每毫升1×107個(gè)，分別取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋下。觀察接種后裸鼠進(jìn)食、飲水、毛發(fā)、精神、活動(dòng)等情況。每隔7天測(cè)量移植瘤大小(長(zhǎng)徑和短徑)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=ab2/2，以每組裸鼠移植瘤體積的平均值，綜合測(cè)量數(shù)據(jù)繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)70天時(shí)麻醉處死裸鼠，在超凈工作臺(tái)上完整剝離腫瘤，稱移植瘤重量，計(jì)算瘤重抑瘤率：瘤重抑瘤率=(1-高表達(dá)瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%。移植瘤組織固定于10%中性福爾馬林中。

1.8 免疫組化 免疫組化染色采用MaxVision法，一抗室溫60 min，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3 min×3次，滴加即用型MaxVision試劑，室溫下15 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固、鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡觀察 相差顯微鏡顯示，MGC803細(xì)胞大小不一，大部分呈長(zhǎng)梭形，異型性明顯，RORα高表達(dá)細(xì)胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性顯著降低(圖1)。這表明RORα高表達(dá)可促進(jìn)MGC803細(xì)胞向上皮轉(zhuǎn)化。

AB

圖1 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞形態(tài)的影響：A.MGC803；B.RORα/MGC803

2.2 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞EMT相關(guān)分子的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)可明顯下調(diào)MGC803細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)(P<0.05，圖2)。并且，RT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)可下調(diào)vimentin和上調(diào)E-cadherin mRNA與蛋白表達(dá)(P<0.05，圖3、4)。

圖2 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

圖3 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞vimentin表達(dá)的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

圖4 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)RORα高表達(dá)對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Snail蛋白定位胞核，vimentin與E-cadherin蛋白定位于胞質(zhì)。RORα高表達(dá)組細(xì)胞Snail與vimentin陽(yáng)性信號(hào)較對(duì)照組明顯減弱，E-cadherin陽(yáng)性信號(hào)顯著增強(qiáng)，與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致(圖5)。

2.4 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，移植瘤體積逐漸增大，而RORα高表達(dá)組較對(duì)照組生長(zhǎng)減慢(P<0.05，圖6)。RORα高表達(dá)組移植瘤瘤重(3.90±0.33)較對(duì)照組(5.31±0.37)明顯降低，抑瘤率為26.55%(P<0.05，圖7)，表明RORα可在體內(nèi)抑制MGC803細(xì)胞移植瘤的形成。

2.5 RORα高表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤組織EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HE染色可見(jiàn)，對(duì)照組移植瘤細(xì)胞核大深染，核質(zhì)比大，核分裂較多，異型性明顯；RORα高表達(dá)細(xì)胞異型性降低，核染色變淺，可見(jiàn)腺樣結(jié)構(gòu)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)組較對(duì)照組的Ki-67、CD34與vimentin蛋白表達(dá)均明顯減弱，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖8)。

圖5 RORα高表達(dá)對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 RORα高表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

圖7 RORα高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

3 討論

研究認(rèn)為，RORα在腫瘤中起著抑癌基因的作用。RORα在胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、白血病等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)RORα表達(dá)可體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲等惡性表型，RORα通過(guò)經(jīng)典與非經(jīng)典的核受體途徑調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲等功能，提示RORα可能是腫瘤治療靶點(diǎn)[4]。研究結(jié)果顯示，RORα在乳腺癌組織與細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，RORα和SEMA3F的mRNA水平減少與不良預(yù)后有關(guān)。恢復(fù)RORα表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力與裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和SEMA3F表達(dá)上調(diào)。表明RORα是潛在的腫瘤抑制基因[7]。研究發(fā)現(xiàn)，RORα在肝癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，與血清AFP、病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)、血管侵襲和預(yù)后密切相關(guān)，并且，RORα高表達(dá)可減少肝癌細(xì)胞需氧糖酵解和下調(diào)生物合成途徑，上調(diào)p21，抑制PDK2表達(dá)和磷酸化[8,9]。但是，RORα抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲與轉(zhuǎn)移是否與EMT有關(guān)，尚不清楚。

眾所周知，腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移起始的重要步驟，而EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵。EMT是指在多種細(xì)胞因子的共同調(diào)節(jié)下，具有極性的上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力間質(zhì)表型細(xì)胞的過(guò)程。上皮源性腫瘤細(xì)胞通過(guò)EMT獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，除發(fā)生形態(tài)學(xué)改變外，細(xì)胞與基膜的連接等上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，如上皮標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、α-SMA、N-cadherin等上調(diào)以及Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)。此時(shí)，腫瘤細(xì)胞間的連接變得疏松，細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生重組，細(xì)胞黏附能力下降，遷移能力增強(qiáng)，更易于離開原有位置發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT是啟動(dòng)腫瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在，阻止EMT已經(jīng)成為抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的新治療策略[10,11]。 本組實(shí)驗(yàn)在RORα高表達(dá)抑制人胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的基礎(chǔ)上[6]，進(jìn)一步探討RORα高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞EMT的影響。相差顯微鏡顯示，RORα高表達(dá)細(xì)胞較MGC803細(xì)胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性降低?；赟nail、E-cadherin 與vimentin是腫瘤EMT的關(guān)鍵分子[12,13]，Ki-67是腫瘤增殖能力的重要指標(biāo)[14]，CD34是血管形成的標(biāo)志[15]。本組Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)可明顯下調(diào)MGC803細(xì)胞Snail與vimentin和上調(diào)E-cadherin表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RORα高表達(dá)組移植瘤較對(duì)照組生長(zhǎng)減慢，體重明顯降低，癌細(xì)胞異型性降低，Ki-67、CD34與vimentin陽(yáng)性均明顯降低，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果證明RORα高表達(dá)通過(guò)下調(diào)Snail與vimentin和上調(diào)E-cadherin表達(dá)可體內(nèi)外抑制人胃癌細(xì)胞EMT。

圖8 RORα高表達(dá)對(duì)移植瘤EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，SP法

研究表明，RORα可通過(guò)Wnt5a/PKC、p53-dependent、Hypoxia/Angiogenesis、NF-κB等多種信號(hào)途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[5]。Lee等報(bào)道，RORα通過(guò)Wnt5a與PKC依賴方式負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，抑制β-catenin介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活Wnt/β-catenin靶基因功能。RORα可通過(guò)絲氨酸35殘基磷酸化，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-catenin，抑制Wnt/β-catenin靶基因cyclin D1、c-myc、Axin，從而調(diào)控細(xì)胞增殖與腫瘤進(jìn)展[16]。此外，RORα可依賴PGE2/PKCα途徑磷酸化減弱結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt靶基因表達(dá)[17]。然而，RORα抑制人胃癌細(xì)胞EMT是否通過(guò)Wnt/β-catenin途徑調(diào)控的詳細(xì)分子機(jī)制尚待深入研究。

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Overexpression of RORα inhibits epithelial-mesenchymal transformation in human gastric cancer MGC803 cells

SU Jian1,2, ZHAO Xiao-hong2,3, LIU Fang2, XIA Hong2, SU Bo2, LING Hui2, ZENG Xi2, SU Qi2

(1DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2CancerResearchInstitute,CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversity,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;3DepartmentofObstetricsandGynecology,theHainanMaternalandChildHealthHospital,Haikou570206,China)

Purpose To investigate the influence of RORα overexpression on theepithelial-mesenchymal transformation (EMT) underlying construction of human gastric cancer MGC803 cells of RORα overexpression. Methods The morphological effect of MGC803 cells in the overexpression of RORα was observed by phase-microscope. The correlative molecules with EMT were detected by RT-PCR, Western blot, immunofluorescence and immunohistochemistry. The influence of xenograft tumor growth in athymic mice was observed on the overexpression of RORα. Results Phase-microscopy showed that MGC803 cells were size unification, round or ellipse and heteromorphism degrade in the overexpression of RORα. Western blot exhibited obviously the downregulation of Snail protein in the overexpression of RORα (P<0.05). RT-PCR and Western blot disclosed that the overexpression of RORα downregulated notably the expression of vimentin and upregulated E-cadherin mRNA and proteins (P<0.05). Immunofluorescence disclosed that the positive signal of Snail and vimentin protein was attenuate, but E-cadherin was strengthened in MGC803 cells of RORα overexpressiongroup. The xenograft tumor growth was markedly decreased , body weight of transplantation tumor visibly reduced and a inhibition ratio 26.55% (P<0.05) compared with that of the control group. And the protein expression of Ki-67, CD34 and vimentin was obviously decreased and the expression of E-cadherin increased in the RORα overexpression group. Conclusion The overexpression of RORα can remarkably inhibit EMT in MGC803 cellsinvivoandinvitro.

stomach neoplasms; RORα; human gastric cancer MGC803 cells; epithelial-mesenchymal transformation

時(shí)間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.014.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(81374013、81102854)

1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，衡陽(yáng) 4210012南華大學(xué)腫瘤研究所/湖南省胃癌研究中心/湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 4210013海南省婦幼保健院婦產(chǎn)科，?？?570206

蘇 堅(jiān)，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: sj5929@163.com 蘇 琦，男，博士生導(dǎo)師，教授，通訊作者。E-mail: suqi1945@163.com

R 735.2

A

1001-7399(2017)02-0143-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.006

接受日期：2016-12-16