李 菲

MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達(dá)變化及臨床意義

李 菲

目的 比較MicroRNA-101(miR-101)、L型鈣通道β2(L-type calcium channel β2Subunit，CACNB2)及鈉鈣交換體(NCX)在房顫(AF)病人血清中的表達(dá)變化，并分析其臨床意義。 方法 篩選2014年3月—2015年3月來就診的100例AF病人為研究對象，設(shè)為試驗組(n=100)；同時選取100例正常病人作為空白對照組(n=100)。試驗時，分別應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法檢測兩組右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性，闡述 miR-101 在房顫發(fā)生與維持中可能機(jī)制及臨床檢測意義。 結(jié)果 ①治療前，兩組受試者在年齡、性別、手術(shù)方式等臨床資料比較無有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，試驗組左房內(nèi)徑(58.9±7.2)mm，大于對照組(37.9±8.1)mm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②實時熒光定量 PCR結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量(0.620 7±0.132 1)，較正常病人(2.310 0±0.342 2)低；AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道m(xù)RNA表達(dá)量(1.980 0±0.315 1，1.802 7±0.281 1)，較正常病人(0.752 6±0.383 0，0.602 1±0.291 1)表達(dá)量高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫印跡(Western blot)結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平(1.36±0.18，1.46±0.12)均較正常病人(1.10±0.25，1.06±0.21)高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 AF病人右心耳組織中 miR-101的表達(dá)水平與AF的發(fā)生具有相關(guān)性，CACNB2、NCX通道是miR-101的靶向調(diào)控位點，參與AF的發(fā)生。

房顫；MicroRNA-101；L型鈣通道β2；鈉鈣交換體

房顫(AF)是臨床中常見的一種心房電生理紊亂疾病，病人表現(xiàn)為無序的快速心房顫動，失去心肌的正常收縮、舒張功能，容易引發(fā)心功能受損、血栓等嚴(yán)重并發(fā)癥。 微小 RNA(microRNAs)在AF的發(fā)生過程中具有重要作用，其中microRNA-101(miR-101)是AF疾病表征的重要指標(biāo)[1-2]。L 型鈣通道β2亞基(CACNB2)[3]和鈉鈣交換體(NCX)[4]的表達(dá)水平變化可能與miR-101的水平變化有緊密聯(lián)系，成為導(dǎo)致AF的重要原因，但是一直沒有相關(guān)報道進(jìn)行研究證實。本次研究針對AF病人右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測，初步探討了miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性及miR-101在AF疾病發(fā)生中的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選取2014年3月—2015年3月就診的AF病人，采集病史并完善術(shù)前檢查，共選出100例AF病人作為試驗組，男性50例，女性50例，年齡30歲～55歲(40.28歲±5.17歲)。同時篩選100例正常病人作為空白對照，男性47例，女性53例，年齡30歲～55歲(40.30歲±4.87歲)。所有參試者均自愿簽訂同意書，參加本次研究。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 臨床確診為AF病人。排除標(biāo)準(zhǔn)：口服鈣離子拮抗劑；感染性心內(nèi)膜炎和風(fēng)濕性疾??；糖尿病；肝腎功能障礙；各種精神疾患。

1.1.3 失聯(lián)原因及其應(yīng)對措施 預(yù)計原因為中途退出試驗或者在試驗過程中轉(zhuǎn)院治療；應(yīng)對措施為按照1∶1比例相應(yīng)補(bǔ)充受試病人進(jìn)試驗組。

1.1.4 倫理學(xué)考量 病人及其直系家屬在充分了解研究過程的基礎(chǔ)上簽署參與該臨床研究的知情同意書；相關(guān)診治和監(jiān)護(hù)措施均以臨床指南相關(guān)原則為依據(jù)，對病人的醫(yī)療治療和安全有充分保障；對信息及診療記錄予以保密，保護(hù)隱私權(quán)；試驗過程遵循《渥太華工作組關(guān)于臨床試驗注冊的聲明》(Ottawa Group Statement for Clinical Trial Registration)。

1.1.5 雙盲原則 研究人員分為4組：第一組研究人員負(fù)責(zé)篩選和隨機(jī)分配試驗對象；第二組負(fù)責(zé)施行疼痛治療；第三組負(fù)責(zé)進(jìn)行觀察指標(biāo)數(shù)據(jù)采集；第四組負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計分析以及文章撰寫。試驗對象的分組情況嚴(yán)格保密：試驗對象和具體施行鎮(zhèn)痛治療的研究人員均不清楚試驗對象的具體分組。4個研究組的研究人員對各自的操作互相保密。

1.2 方法 將100例AF病人設(shè)為試驗組(n=100)，100例正常病人作為空白對照組(n=100)。試驗時，應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法，檢測右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.2.1 檢測方法 灌注心肌停搏液前剪取200 g左右右心耳組織，用冰生理鹽水洗凈后剪成兩部分，分別置于兩個凍存管中(不含RNA酶)，迅速放入液氮中凍存，凍實后快速置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 PCR檢測miR-101表達(dá)水平 將-80 ℃冰箱中保存的右心耳組織取出稱重，冰上剪碎后加入1 mL的Buffer RLM 組織裂解液；片刻后，將裂解液轉(zhuǎn)移到DEPC 處理水處理過的 5 mL 勻漿管中，將組織充分粉碎、混勻，室溫下放置5 min；待組織充分裂解后，加入200 μL 氯仿，振蕩 15 s 后室溫靜置 5 min。再將裂解液置于4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相置于1.5 mL EP管中，加入1/2體積的無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入收集管(Collection Tube 2 mL)內(nèi)的吸附柱R(Mspin Column RM)中，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s，收集流出液，加入2/3體積無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱RS中，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，將吸附柱RS重新放入收集管中，加入 700 μL Buffer RWT，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，再次向吸附柱RS中加入500 μL LBuffer RW2，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，重復(fù)加入500 μL Buffer RW2，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心1 min后，將吸附柱 RS 置于室溫下晾干。最后，將吸附柱 RS 置于干凈1.5 mL 離心管中，加入 20 μL～30 μL RNase-Free Water，室溫下靜置 1 min，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心1 min后，收集溶液，測定總microRNA 濃度和純度。通過microRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行熒光定量 PCR。熒光定量 PCR使用美國ABI7500 實時熒光定量PCR儀完成，每樣設(shè)定3個平行，嚴(yán)格按照說明操作。

1.2.3 免疫印跡(Western blot)法 將右心耳組織取出后處理，加入500 μLRIPA 裂解液裂解，再加入蛋白酶抑制劑(1 mM)，待充分混勻、裂解后，靜置15 min，置于4oC離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行BCA試劑盒對蛋白定量，使用SDS-PAGE 電泳法得到凝膠圖像，進(jìn)行半定量分析。嚴(yán)格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組在年齡、性別、手術(shù)方式等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；超聲心動圖結(jié)果顯示AF病人左房內(nèi)徑(58.9±7.2) mm。較對照組(37.9±8.1) mm顯著增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組miR-101、CACNB2和NCX通道m(xù)RNA的表達(dá)水平 試驗組miR-101表達(dá)水平較對照組低，CACNB2和NCX通道的mRNA水平均較對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別nmiR-101CACNB2的mRNA水平NCX的mRNA水平試驗組1000.6207±0.13211.9800±0.31511.8027±0.2811對照組1002.3100±0.34220.7526±0.38300.6021±0.2911P<0.05<0.05<0.05

2.3 免疫印跡法對CACNB2和NCX蛋白表達(dá)水平分析 CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平均較對照組高，與CACNB2和NCX通道的mRNA水平具有相同的變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

組別nCACNB2蛋白表達(dá)NCX蛋白表達(dá)試驗組1001.36±0.181.46±0.12對照組1001.10±0.251.06±0.21P<0.05<0.05

3 討 論

AF是一種嚴(yán)重的心律失常疾病，病人失去規(guī)則有序的心房活動，導(dǎo)致心房顫動。近年來，伴隨人口老齡化日益加重，我國AF患病率逐年上升，嚴(yán)重影響了人們的健康生活，特別是高致死率的特點成為AF病人的巨大陰影。由于現(xiàn)在醫(yī)療條件和科技發(fā)達(dá)程度的限制，人們對于AF的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前針對AF的治療主要包括抗凝藥物和抗心律失常藥物的開發(fā)和使用，但是對于持續(xù)性AF的治療具有很大限制。為了臨床AF防治手段的開發(fā)，探索AF的發(fā)病機(jī)制，需找新的靶點成為醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。

研究報道[5-7]，miR-101表達(dá)量的下調(diào)可能與AF的發(fā)生有關(guān)。隨后研究者又發(fā)現(xiàn)CACNB2[3]、NCX[4，8]可能是miR-101的靶基因，但是未給出深入研究。另外，關(guān)于CACNB2的表達(dá)變化與miR-101表達(dá)之間的關(guān)系也尚未可知。

本研究針對miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)量與AF之間的相關(guān)性及CACNB2、NCX表達(dá)量與miR-101表達(dá)量的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了驗證。以AF病人為主要研究對象，設(shè)為試驗組，與非AF病人進(jìn)行對照研究。結(jié)果表明，兩組在年齡、性別、手術(shù)方式等方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，AF病人左房內(nèi)徑較對照組顯著增大。通過生物信息學(xué)手段，對兩組病人右心耳組織中的總microRNA表達(dá)量和CACNB2、NCX通道的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測。實時熒光定量 PCR結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量較正常病人低，與文獻(xiàn)報道一致[9-10]。證實了右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量與AF有關(guān)，在AF病人中的表達(dá)量下調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道的mRNA表達(dá)量較正常病人表達(dá)量高，說明右心耳組織中的CACNB2、NCX通道與AF的發(fā)生也具有相關(guān)性，參與AF的發(fā)生。通過免疫印跡法對CACNB2和NCX蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平均較正常病人高，與CACNB2和NCX通道的mRNA表達(dá)量具有相同的變化規(guī)律，符合microRNA-101的生理調(diào)節(jié)規(guī)律，證實了CACNB2和NCX通道作為microRNA-101的調(diào)節(jié)靶點，參與了AF的發(fā)生。由于NCX是心肌細(xì)胞膜上的一種膜轉(zhuǎn)運蛋白，具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的作用。NCX表達(dá)量的改變證明了電子通道在AF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[8，11]，也說明了心肌細(xì)胞內(nèi)過量的鈣離子對引發(fā)AF發(fā)生的重要作用[12]。

microRNA-101表達(dá)量與AF的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)，即AF病人血清中的microRNA-101表達(dá)下調(diào)。此外，CACNB2和NCX蛋白與microRNA-101的表達(dá)相關(guān)，即microRNA-101上調(diào)CACNB2和NCX的表達(dá)，繼而誘發(fā)或加重AF。

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(本文編輯王雅潔)

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分院(上海 200092)，E-mail：gghvx2342@163.com

引用信息：李菲.MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達(dá)變化及臨床意義[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(6)：712-714.

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B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.027

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2016-09-03)