任衛(wèi)全，于 雪，范瀟婷，王 偉，郭淑貞

芪參顆粒對后負荷加重小鼠心肌組織中Fas/Fasl凋亡信號轉導通路的影響

任衛(wèi)全，于 雪，范瀟婷，王 偉，郭淑貞

目的 從細胞凋亡角度探討芪參顆粒(QSG)對后負荷加重小鼠心肌保護的作用機制。方法 40只SPF級雄性C57小鼠按體質(zhì)量分為手術組(30只)和假手術組(10只)，手術組利用主動脈弓縮窄術制備小鼠心肌肥厚模型，將成模后存活小鼠隨機分為3組：模型組，芪參顆粒組和福辛普利組，每組10只。治療4周后取小鼠心臟組織進行Western blot檢測Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表達，實時熒光定量PCR法檢測Fas和caspase8水平。結果 Western blot結果顯示：與假手術組相比，模型組的Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表達均顯著升高(P <0.05)；與模型組相比，芪參顆粒組、福辛普利組可明顯下調(diào)心肌肥厚小鼠心肌組織中Fas、caspase8和 cleaved-caspase3(P <0.05)的蛋白表達，芪參顆粒組較福辛普利組更有優(yōu)勢；實時熒光定量PCR結果顯示，芪參顆粒組、福辛普利組均有下調(diào)心肌肥厚小鼠心肌組織中Fas、caspase8表達的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 在轉錄后水平調(diào)節(jié)Fas/Fasl凋亡信號轉導通路相關蛋白、抑制凋亡可能是芪參顆粒發(fā)揮對后負荷加重小鼠心肌保護作用的重要機制之一。

心肌肥厚；芪參顆粒；細胞凋亡；Fas/Fasl；小鼠

心肌肥厚是高血壓、心瓣膜病等多種心血管疾病的共同并發(fā)癥，是由多條信號轉導通路和眾多的信號分子導致心肌結構、功能的改變，其中就包括心肌細胞凋亡的過程[1-3]。目前認為 Fas/Fasl 系統(tǒng)介導的細胞凋亡信號通路是細胞凋亡的重要途徑之一[4- 5]。而caspase 家族蛋白酶的激活在細胞凋亡的執(zhí)行過程中起著關鍵作用，其中 caspase3是caspase 家族成員中最重要的蛋白之一，caspase3切割(cleaved)活化之后就會變成cleaved-caspase3，即后者是前者的活化形式。caspase3 蛋白酶參與多種途徑誘導的細胞凋亡，與細胞凋亡的關系十分緊密。同時，caspase8 作為 caspase 的啟動者，而 caspase3 被劃分為caspase 的執(zhí)行者[6]。芪參顆粒(QSG)組成成分包括黃芪、丹參、甘草等藥味，可以有效地防治心肌肥厚及心衰[7- 8]。本研究從細胞凋亡的角度，探討芪參顆粒對后負荷加重小鼠(TAC)心肌保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 正常6周齡SPF 級雄性C57小鼠40只，體質(zhì)量(16±1)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。40只雄性C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為兩組：手術組30只，假手術組10只。手術組行TAC(Transverse Aortic Constriction) 造模術。將其中30只造模成功的小鼠按照體質(zhì)量分為3組：模型組，福辛普利組和芪參顆粒組。10只假手術組動物除穿線不結扎外，其余同手術組。

1.2 藥物與試劑 QSG由黃芪、丹參、甘草等藥味組成，藥材均購于北京同仁堂制藥有限公司。處方諸藥合并，采用水提醇沉工藝制備，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提供。福辛普利中美上海施貴寶制藥有限公司提供(批準文號：國藥準字H19980197)；Trizol Reagent (ambion，15596026，made in USA)； Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific，K1622)；SYBR Select Master MIX (applied Biosystems，4472908，made in USA)；RIPA裂解緩沖液(北京普利萊基因技術有限公司，貨號：C1053)；Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒(貨號：P1510)；Anti-Fas antibody(Proteintech，貨號：60196-1-lg)；Anti-Caspase8 antibody(Proteintech，貨號：13423-1-AP)；Anti-Caspase3 antibody(Proteintech，貨號：19677-1-AP)。

1.3 儀器 小動物呼吸機( SAR-1000ventilator 美國) 、鵝頸冷光源、小鼠外科顯微手術器械、Vevo2100 超聲儀( Visual Sonics 加拿大)；凝膠成像儀及圖像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD，Molecular Imager ChemiDocTM XRST with ImageLabTM software)；電泳及電轉系統(tǒng)(Miniin，美國Bio-Rad，MiniPROTEANR Tetra Cell 552BR 057972；Mini Trans-BlotR Cell153BR 74593)； ABI StrpOnePlus Real-Time PCR System(美國ABI公司)。

1.4 復制壓力負荷型心衰小鼠模型的方法 稱重與麻醉： 小鼠(16±1)g稱重，經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉。固定、氣管插管和機械通氣，麻醉后開胸；胸廓酒精消毒，自制插管(22G靜脈套管針外鞘)進行氣管插管，隨后將5-0真絲編織線用鉤狀彎鑷提出，使得絲線包繞過主動脈弓進行結扎，打結后，關胸。假手術組動物僅行開胸操作，而不進行主動脈弓縮窄操作，其余操作步驟與模型組相同[9]。

1.5 給藥 術后第2天開始給藥，QSG組每日給予生藥QSG 14.66 g/kg，相當于臨床等效劑量；福辛普利組每日予福辛普利1.83 mg/kg，均以水溶，每天灌胃給藥，灌胃體積為1.0 mL/100 g；假手術組和模型組每日給予相同體積純水灌胃，持續(xù)4周。給藥4周，摘取心臟，稱重后留取左心室組織，放入液氮內(nèi)保存。

1.6 熒光定量PCR法檢測Fas、caspase8的表達 熒光定量PCR引物、探針序列(見表1)；Trizol法在冰上提取細胞總RNA；逆轉錄cDNA；將cDNA產(chǎn)物放在-20℃保存；實時定量熒光PCR； 2-△△CT法分析基因相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.7 Western blot檢測Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的蛋白表達 蛋白質(zhì)提?。簯肦IPA裂解緩沖液提取總蛋白，應用Bradford法蛋白質(zhì)定量；配制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，12%)；SDS-PAGE電泳：選取恒壓(80V)進行電泳；SDS-PAGE轉膜印跡：恒壓(75V)進行電轉70 min；用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；免疫反應：Fas、caspase8和cleaved-caspase3(稀釋比例均為1∶1 000)一抗雜交袋中4℃過夜。二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫搖床60 min；顯影：ECL發(fā)光液曝光顯影，BIO-RAD XRS凝膠成像儀分析，記錄每條蛋白泳帶的灰度值，進行定量分析。

2 結 果

2.1 Western blot檢測Fas、caspase8和cleaved-caspase3的蛋白表達 在蛋白質(zhì)相對分子量為65KD和42 KD處有條帶，分別是Fas和β-actin蛋白表達；蛋白質(zhì)caspase8的相對分子量為42KD；蛋白質(zhì)cleaved-caspase3的相對分子量是18 KD；模型組較假手術組Fas、caspase8和 cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高(P <0.05)，治療后芪參顆粒組和福辛普利組的Fas、caspase8和cleaved-caspase3蛋白表達均有下降，且與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。詳見圖1。

注：A為各組蛋白印跡(1、2、3、4分別為假手術組、模型組、芪參顆粒組、福辛普利組)；B為Fas蛋白各組表達量；C為caspase8蛋白各組表達量；D為cleaved-caspase3蛋白各組表達量。與假手術組比較，#P <0.05，##P <0.01；與模型組比較，△P <0.05，△△P <0.05。 圖1 Western blot檢測各組小鼠心肌組織中Fas、caspase8和 cleaved-caspase3蛋白表達

2.2 實時定量熒光PCR檢測Fas、caspase8的表達 模型組較假手術組Fas、caspase8 基因表達升高；與模型組相比，芪參顆粒組能降低心肌中Fas、caspase8基因的表達，無統(tǒng)計學意義，但有一定的趨勢。詳見圖2。

注：A為Fas基因各組表達量；B為caspase8基因各組表達量。圖2 實時定量熒光PCR檢測各組小鼠心肌組織中Fas、caspase8基因表達

3 討 論

心肌肥厚是多種心血管疾病的并發(fā)癥，其是心衰發(fā)生的獨立危險因素，能夠對心肌肥厚逆轉治療，減少心衰的發(fā)生和死亡率[9]。研究已經(jīng)證實，主動脈弓縮窄術小鼠模型是還原壓力超負荷導致心肌代償性肥大到失代償性心衰病理生理發(fā)展過程的理想模型[10]。

細胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)，1972年由Kerr，Wyllie和Currie首次提出并指出其不同于普通的細胞死亡[11]。關于心肌細胞凋亡的分子機制研究很多，心衰過程中細胞凋亡誘導因素也很多，目前研究比較完善的通路為AngⅡ介導的凋亡通路，其他因素介導的復雜繁多信號凋亡通路還不清楚[12]。本實驗所研究的是TNF 受體家族轉導途徑，其中最為關鍵的一部分就是Fas介導的細胞凋亡信號轉導通路，并起到?jīng)Q定性作用的一部分。Fas存在于靶細胞上，F(xiàn)asL通過三聚體的形式與之相結合。誘導、Fas 三聚化，從而激活 Fas 相關的死亡結構域(FADD)，F(xiàn)ADD 能夠通過C端的DD結合Fas；另外它能通過其N端具有致凋亡能力的死亡效應結構域(DED)招募procaspase 8到Fas 區(qū)域。caspase8自我剪切活化，從而啟動了caspase家族酶鏈反應，cleaved-caspase3是 caspase家族酶鏈反應的最終執(zhí)行者，最終影響了細胞的結構蛋白，從而導致細胞凋亡的發(fā)生[13]。心臟超負荷早期心肌細胞代償性肥大，隨著病程的惡化，細胞凋亡導致心肌細胞數(shù)量減少。因此，各種方式誘導的細胞凋亡使心肌細胞大量丟失，當細胞數(shù)量減少到一定程度，心室重構，收縮力下降可能導致心衰[14- 15]。凋亡同時又加速心衰進展，抑制心肌細胞凋亡可以減輕心臟重構，改善心功能。

通過本研究可以明確的結論有：后負荷加重小鼠心肌細胞內(nèi)Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表達較假手術組升高，即心肌肥厚乃至心衰的確會促進細胞凋亡的發(fā)生，這一點與國內(nèi)外的研究結論一致。芪參顆粒用藥4周后對Fas、caspase8和cleaved-caspase3表達的確有影響，并優(yōu)于福辛普利，即對細胞凋亡的調(diào)控確實是芪參顆粒心肌保護作用的機制之一。

仍需進一步研究的問題：western blot結果顯示在蛋白水平，芪參顆粒確實起到了調(diào)節(jié)Fas/Fasl信號通路蛋白的作用，并且作用顯著，但在轉錄水平，實時定量熒光PCR結果顯示芪參顆粒對Fas、caspase8基因表達的調(diào)控沒有統(tǒng)計學意義，表明芪參顆粒對于Fas、caspase8的影響主要在轉錄后環(huán)節(jié)。在后期實驗中本課題組會根據(jù)不同的模型進行多方位的驗證，在已有實驗結論的基礎上進一步探索芪參顆粒通過調(diào)節(jié)細胞凋亡通路改善心肌功能的作用。

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(本文編輯王雅潔)

Qishen Granule Regulated the Fas/Fasl Apoptotic Pathway in Myocardial Tissues of Mice with Transverse Aortic Constriction

Ren Weiquan， Yu Xue， Fan Xiaoting， Wang Wei， Guo Shuzhen

School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Guo Shuzhen

Objective To explore the mechanism of Qishen granule (QSG) on the myocardial protection in mice with transverse aortic constriction (TAC).Methods Forty SPF grade male C57 mice were divided into operation group (n=30) and sham operation group (n=10) according to the body mass.Mice in the operation group were prepared by transverse aortic constriction to induce cardiac hypertrophy， and then were randomly divided into model group(n=10)， QSG group (n=10) and fosinopril group (n=10).After 4 weeks of treatment according to group， the left ventricular was collected.Subsequently， the protein of Fas， caspase 8 and cleaved-caspase 3 were analyzed by western-blot while the mRNA expression of Fas and caspase 8 were tested by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Protein expression of Fas caspase 8 and cleaved-caspase 3 increased dramatically in model group comparing to sham group (P<0.05).Compared with model group， the protein expression of Fas， caspase 8 and cleaved-caspase 3 decreased in QSG group and fosinopril group (P<0.05)，which was lower in QSG group than that in fosinopril group.The result of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the the mRNA expression of Fas and caspase 8 in the myocardium of myocardium was decreased， but there was no significant difference (P>0.05).Conclusion QSG regulated moleculars in Fas/Fasl apoptotic pathway at their post-transcription stage and then decreased apoptosis in myocardial tissue with hypertrophy.

cardiac hypertrophy；Qishen granule；apoptosis；Fas/Fasl

北京市科技新星(No.xx2014A009)；杰出青年人才項目(No.2015-JYB-XYQ002)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(No.NCEF13-0692)

北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院(北京 100029)

郭淑貞，E-mail：guoshz@bucm.edu.cn

R285.5 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.009

1672-1349(2017)06-0667-04

2017-01-18)

引用信息：任衛(wèi)全，于雪，范瀟婷，等.芪參顆粒對后負荷加重小鼠心肌組織中Fas/Fasl凋亡信號轉導通路的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(6)：667-670.