余長艷 甄麗娜 李洪濱 張 悅 張清媛

·基礎(chǔ)研究·

腫瘤相關(guān)巨噬細胞在三陰性乳腺癌中的表達與臨床病理因素及預(yù)后關(guān)系的研究

余長艷 甄麗娜 李洪濱 張 悅 張清媛

目的探討腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)在三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中的表達及其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化染色法檢測108例TNBC組織中TAMs的表達情況，同時檢測癌組織中微血管密度(Microvessel density，MVD)，分析TAMs表達與TNBC臨床病理參數(shù)、MVD及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 TAMs表達與患者年齡無關(guān)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM分期及MVD密切相關(guān)。生存分析顯示TAMs與TNBC術(shù)后5年無病生存時間(Disease-free survival，DFS)及總生存時間(Overall survival，OS)相關(guān)；MVD與5年DFS相關(guān)，而與OS未見相關(guān)性。Cox回歸分析示TAMs是TNBC預(yù)后不良的獨立危險因素。結(jié)論 TAMs高表達提示TNBC預(yù)后不良，TAMs可成為判斷預(yù)后的免疫指標(biāo)之一。TAMs與MVD密切相關(guān)，可能通過促進瘤內(nèi)血管增生，從而促進TNBC的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，進一步影響TNBC患者的預(yù)后。

三陰性乳腺癌；腫瘤相關(guān)巨噬細胞；微血管密度；預(yù)后

腫瘤微環(huán)境對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境中重要成分，所占比例可達間質(zhì)細胞的50%～80%。研究表明眾多人類腫瘤中均有TAMs的浸潤，TAMs與惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切；此外，TAMs可分泌促血管生成因子如VEGF，促進腫瘤血管網(wǎng)的建立，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)及轉(zhuǎn)移通路[1]。我們既往研究證明，TAMs在乳腺癌中的浸潤與腋下淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。但是，其在三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中的表達尚不明確。TNBC是乳腺癌中的一種特殊類型，目前對于TNBC中TAMs的表達及預(yù)后意義的研究較少，尚無TAMs與微血管密度(Microvessel density，MVD)關(guān)系的報道。本研究中我們利用免疫組織化學(xué)染色法檢測108例TNBC中TAMs的表達，并分析其表達與臨床病理因素、生存預(yù)后及與MVD的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2006年1月—2008年12月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行乳腺癌改良根治手術(shù)、臨床病理及預(yù)后資料完整的TNBC標(biāo)本108例。所有標(biāo)本經(jīng)病理科醫(yī)生確診為浸潤性導(dǎo)管癌，術(shù)前均未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療。手術(shù)方式為改良根治術(shù)或保乳手術(shù)。主要排除標(biāo)準(zhǔn)為患者在確診時存在遠處轉(zhuǎn)移、局部進展期疾病、炎性乳癌，雙乳癌及失訪病例。患者均為女性，年齡范圍32～75歲，中位年齡51歲；患者隨訪至少5年或至患者死亡。

1.2 實驗試劑

鼠抗人單克隆CD68抗體(ZM-0464)、鼠抗人單克隆CD34抗體(ZM-0046)、增強型二步法檢測試劑盒(PV6002)、DAB顯色劑(ZLI-9018)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

TAM染色方法為常規(guī)ABC免疫組化法。組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，脫蠟水化后，置入檸檬酸緩沖液中，高溫高壓或微波技術(shù)行抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶，組織滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(CD68、CD34)，后滴加羊抗鼠的IgG/HRP聚合物標(biāo)記二抗，顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，封片。以已知染色陽性的乳腺癌切片為陽性對照，用PBS緩沖液取代一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

TAMs：CD68陽性細胞的判定即TAMs的計數(shù)方法參照國外學(xué)者提供的方法進行。以細胞漿含棕黃色顆粒者為陽性細胞，觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)該區(qū)域陽性細胞數(shù)目，其均值為該病例數(shù)值。以TAM表達中位數(shù)為閾值，將樣本分為2組，高于中位數(shù)的為TAM高表達組(TAM≥45.5個/高倍視野)，低于中位數(shù)的為TAM低表達組(TAM<45.5個/高倍視野)。

MVD：CD34染色判定即MVD的判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Weidner微血管計量方法。每一個染成棕黃色的，視為一個單一可計數(shù)的微血管，觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)該區(qū)域陽性細胞數(shù)目，其均值為該病例數(shù)值。以MVD的中位值為劃分基準(zhǔn)，將樣本分為2組，高于中位值的定義為MVD高表達組(MVD≥29.05個/高倍視野)，低于中位值的為MVD低表達組(MCD<29.05個/高倍視野)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。TAMs、MVD與臨床病理因素相關(guān)性的檢驗采用Spearman相關(guān)性分析，TAMs與MVD相關(guān)性采用Rearson相關(guān)性分析，生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法進行，Log-rank檢驗用來比較兩組生存期的差異，應(yīng)用Cox多因素模型進行預(yù)后分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAMs和MVD在TNBC組織中的表達情況

TAMs染色陽性主要為細胞膜及細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒，108例TNBC中，TAMs表達中位值為45.5，以此為閾值將患者分成2組：TAMs高表達組54例(圖1A)，TAM低表達組54例(圖1B)。CD34標(biāo)記的MVD呈現(xiàn)棕褐色，陽性染色定位于血管內(nèi)皮細胞，108例TNBC中MVD的中位值為29.05，將大于中位值的腫瘤血管密度定義為高血管密度(圖1C)，反之則為低血管密度(圖1D)。

2.2 TAMs及MVD表達與TNBC臨床病理因素的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)TAMs表達與患者年齡無關(guān)，而與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM分期密切相關(guān)，即體積較大(P=0.010)、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.012)、分化差(P=0.006)、TNM期別高(P<0.01)的腫瘤存在TAM高表達(表1)。三陰性乳腺癌患者的臨床特征見表2。

圖1 TNBC中TAMs和MVD的表達Figure 1 Immunohistochemical detection of TAMs(marker CD68)and MVD(marker CD34)in TNBC tissues

表1 TAMs、MVD與臨床病理因素的關(guān)系Table 1 Correlation between CD68 /CD34 expressions and various clinicopathological features

表2 三陰性乳腺癌的臨床特征Table 2 Clinical characteristics of the patients with TNBC

2.3 TAMs及MVD表達與TNBC預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)Log-rank檢驗分析發(fā)現(xiàn)TAM高表達TNBC患者，其5年DFS(P=0.008)及OS(P=0.022)顯著低于TAM低表達組(圖2)。MVD高的患者，其5年DFS顯著低于MVD低的患者(P=0.040)，但與OS未見相關(guān)性(P=0.445)(圖3)。

2.4 Cox單因素及多因素分析

Cox單因素分析顯示年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及TAM表達與預(yù)后相關(guān)。多因素分析顯示淋巴結(jié)存在轉(zhuǎn)移及TAM高表達是乳腺癌預(yù)后不良的獨立危險因素(表3)。

2.5 TAMs與MVD的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析檢驗TNBC中TAMs與MVD的相關(guān)性并做散點圖，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.01)(圖4)。

圖2 TAMs表達與預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Kaplan-Meier analysis for DFS and OS based on CD68 expression in TNBC

圖3 MVD表達與預(yù)后的關(guān)系Figure 3 Kaplan-Meier analysis for DFS and OS based on CD34 expression in TNBC

表3 Cox單因素及多因素分析Table 3 Prognostic factors in the Cox proportional hazards model

圖4 TAMs與MVD的關(guān)系Figure 4 Relationship between TAMs and MVD

3 討論

本研究首次探討了TAMs在TNBC中的表達及其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TAMs表達與TNBC腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期及MVD顯著相關(guān)；TAMs高表達者其5年DFS及OS均低于TAMs低表達者。Cox單因素及多因素分析顯示TAMs高表達是TNBC預(yù)后不良的獨立危險因素。

腫瘤間質(zhì)細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。在腫瘤間質(zhì)細胞中TAMs被認(rèn)為是最重要的一員，所占比例可達50%～80%。研究發(fā)現(xiàn)TAMs通過直接和間接方式促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]，具體機制包括：(1)促進腫瘤細胞分裂：TAMs可分泌生長因子如堿性成纖維細胞生長因子-2(bFGF-2)、表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)[7-8]等，直接促進腫瘤細胞分裂；(2)促進腫瘤血管的生成：一方面TAMs釋放促血管生成因子和生長因子，如VEGF、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)和纖維素生長因子家族等；另一方面TAMs還可以表達調(diào)節(jié)血管生成的酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶類MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和環(huán)氧化酶-2(COX-2)[9-10]，以此促進血管生成；(3)誘導(dǎo)腫瘤浸潤：TAMs能產(chǎn)生許多降解細胞外基質(zhì)(ECM)的酶，如MMP-2、MMP-9和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)，通過促進ECM的降解而利于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]；(4)參與免疫抑制與逃逸：TAMs分泌細胞因子如TGF-β、IL-13等，抑制淋巴細胞，如淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、自然殺傷細胞(NK細胞)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的增殖和分化，抑制抗腫瘤免疫的激活。TAMs的生物學(xué)功能提示其對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起促進作用，可能與腫瘤患者預(yù)后不良密切相關(guān)[12]。在前期研究中我們證實腫瘤間質(zhì)內(nèi)TAMs高表達的乳腺癌患者疾病進展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[13-14]，但是目前對于TNBC中TAMs的表達及預(yù)后的關(guān)系研究較少。本研究進一步探討TAMs在TNBC患者中表達的意義。

TNBC約占乳腺癌的15%～20%。TNBC具有發(fā)病年齡較輕，腫瘤侵襲性強，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的特點，是乳腺癌中預(yù)后較差的類型[15]。因此，如何準(zhǔn)確評估TNBC患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，對于控制疾病復(fù)發(fā)、提高患者生存尤為重要。目前有關(guān)TNBC預(yù)后評價指標(biāo)主要為腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等傳統(tǒng)臨床病理因素。Hernandez-Aya等[16]分析了1711例TNBC患病人群中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對預(yù)后的影響，結(jié)果表明淋巴結(jié)陰性TNBC患者的預(yù)后明顯優(yōu)于淋巴結(jié)陽性患者。Pistelli等[17]針對149例TNBC患者的一項回顧性分析顯示腫瘤大小和淋巴血管侵犯是影響TNBC預(yù)后的獨立因素。上述研究從腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)評估了TNBC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高危因素，而未探討腫瘤患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)與患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。有研究表明TAMs在腫瘤間質(zhì)中的浸潤在不同分子分型乳腺癌中可能存在表達差異[18]。本研究除了首次探討TAMs表達對TNBC預(yù)后的影響，還發(fā)現(xiàn)TAMs表達與MVD密切相關(guān)，提示促進腫瘤血管生成可能是TAMs發(fā)揮作用的重要機制之一。那么，TNBC中的TAMs分泌哪些細胞因子，這些TAMs是否具有更強的免疫抑制功能等問題需要我們進一步深入研究。

TAMs與血管生成兩者之間的相關(guān)性提示在乳腺癌的進展中TAMs促血管生成作用至關(guān)重要。在活體動物實驗中，使用易患乳腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠(PyMT)進行研究，結(jié)果顯示抑制巨噬細胞的成熟和對腫瘤的浸潤可以延遲血管發(fā)生和腫瘤進展，這為TAMs與乳腺癌血管生成的因果關(guān)系提供了更多的證據(jù)[19]，進一步證明了TAMs與乳腺癌血管生成密切相關(guān)。但對于乳腺癌中惡性度高的TNBC亞型，尚缺乏TAMs與血管生成關(guān)系的研究。MVD的測定可以量化血管的生成程度，在本研究中，結(jié)果顯示TNBC中TAMs與MVD正相關(guān)，這與上述理論結(jié)果一致，TAMs可能通過促進血管的生成，進而促進了TNBC的發(fā)展。在一項針對25個獨立研究的Meta分析中，高MVD與乳腺癌DFS和OS差顯著相關(guān)(RFS和OS：RR=1.54，95%CI=1.29～1.84)[20]。目前關(guān)于MVD在TNBC中的測定及臨床意義的研究很少。本研究探討了MVD與TNBC病理因素及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示腫瘤體積較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡性度高、TNM期別較高者MVD值高，這為MVD成為預(yù)測TNBC進展危險度的參考指標(biāo)增加了臨床依據(jù)。生存分析顯示，高MVD者5年DFS較差，而與OS未見相關(guān)性，由于本實驗為小樣本量研究，這一結(jié)果還有待于進一步擴大樣本量來驗證。

綜上所述，TAMs在TNBC的發(fā)生、演變中發(fā)揮了重要作用，是TNBC預(yù)后不良的獨立危險因素。此外，腫瘤的發(fā)展離不開血管的生成，TAMs與TNBC中微血管生成關(guān)系密切，進一步支持了其促腫瘤的功能。這為判定TNBC預(yù)后提供了一個有價值的預(yù)后指標(biāo)，也為今后個體化治療提供了新的方法和思路。

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(收稿：2015-03-19)

The correlations between expression of tumor associated macrophages and the prognostic significances in triple negative breast cancer

YUChangyan，ZHENLina，LIHongbing，ZHANGYue，ZHANGQingyuan

Department of Medical Oncology，The Affiliated Tumor Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150081，China

Objective To explore the significances of expression of tumor associated macrophages(TAMs)and its correlation with microvessel density(MVD)in triple negative breast cancer(TNBC).Methods Immunohistochemistry was used to detect TAMs and MVD expression in 108 TNBC tissues and to analyze the correlation between TAMs with clinicopathological features，prognosis and MVD.Results The expression of TAMs was correlated with the tumor size，lymph node metastasis，histological grade，TNM stage and MVD，but had no statistically significant association with age.TAMs was correlated with 5 year disease free survival(DFS)and overall survival(OS)；MVD was correlated with 5 year DFS，while no correlation with OS.Univariate and multivariate analyses showed that TAMs was an independent unfavorable prognostic factor for patients with TNBC.Conclusion High infiltration of TAMs indicated poor survival rate for patients with TNBC.The infiltration of TAMs was a new，important risk factor for TNBC recurrence.TAMs were closely related to MVD，by promoting tumor angiogenesis，thereby promoting TNBC growth，invasion and metastasis，and further affect the prognosis of patients with TNBC.

Triple negative breast cancer；Tumor associated macrophages；Microvessel density；Prognosis

黑龍江省自然科學(xué)基金(重點項目)(ZD2016018)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(哈爾濱 150081)

余長艷，女，(1991-)，碩士研究生，從事免疫系統(tǒng)在腫瘤中功能變化解析的研究。

張悅，E-mail：18946114826@163.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.001