柴靜波 李 萍 裴志萍

番茄紅素對(duì)荷卵巢癌大鼠免疫功能的影響及其機(jī)制研究

柴靜波1李 萍1裴志萍2

目的研究番茄紅素(LP)改善荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用并探討其機(jī)制。方法 將卵巢癌細(xì)胞NUTU-19接種于腋窩皮下，制備荷卵巢癌大鼠模型，取60只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、順鉑組(2 mg/kg)和LP(40、20、10 mg/kg)組，每組12只；各治療組均隔天腹腔注射給藥一次，共5次。觀察各組大鼠一般生存狀態(tài)和腫瘤生長狀況；稱量腫瘤重量并計(jì)算抑瘤率，通過HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；酶聯(lián)免疫(ELISA)法測定血清中白細(xì)胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量；流式細(xì)胞儀術(shù)(Flow cytometry)檢測血中T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+)百分率并計(jì)算CD4+/CD8+。結(jié)果 與模型組比較，發(fā)現(xiàn)LP各組大鼠飲食狀況好轉(zhuǎn)，瘤體減小、活動(dòng)度和硬度較差，腫瘤組織細(xì)胞皺縮、呈片狀壞死等病變，上述改變以LP 40 mg/kg組最為顯著；LP(40、20 mg/kg)組瘤重顯著減輕且抑瘤率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，血清中IL-2和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，血液中CD8+百分率顯著降低(P<0.05，P<0.01)，LP 40 mg/kg組CD4+百分率顯著升高(P<0.05)，LP(40、20 mg/kg)組CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 LP具有提高荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用，其機(jī)制可能與LP能夠有效降低炎癥細(xì)胞因子(IL-2、TNF-α)含量以及提高CD4+/CD8+比值有關(guān)。

番茄紅素；卵巢癌；大鼠；免疫功能；機(jī)制

婦科惡性腫瘤中卵巢癌致死率高居第一位[1]，嚴(yán)重威脅著女性生命健康。既往病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，免疫活性細(xì)胞和活性因子功能低下，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易于生長和轉(zhuǎn)移[2-3]，因此改善機(jī)體免疫功能或許是研發(fā)抗腫瘤藥物的新思路。番茄紅素(Lycopene，LP)是一種具有良好的抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)作用的胡蘿卜素[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立荷卵巢癌大鼠模型并給予LP干預(yù)治療，以順鉑為陽性對(duì)照藥物，研究LP對(duì)荷卵巢癌大鼠免疫功能的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用Fischer 344大鼠(SPF級(jí)，雌性，鼠齡8周齡，體質(zhì)量130～150 g)購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；低分化人上皮性卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株購自上海橋杜商貿(mào)有限公司細(xì)胞中心；LP購自南京澤朗生物科技有限公司(純度≥96%，批號(hào)：20131217)；注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司(30 mg：6 mL)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；白細(xì)胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自北京博奧生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備與分組 參照鄒黨華等[7]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法建立荷卵巢癌大鼠模型：實(shí)驗(yàn)用人上皮性卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于RPMI-1640培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL，無菌條件下注射接種(0.2 mL)于Fischer 344大鼠右側(cè)腋窩皮下，造模結(jié)果的判定：10天后接種位置出現(xiàn)約0.4 cm×0.4 cm腫瘤即認(rèn)定為造模成功。取60只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、順鉑組(2 mg/kg)和LP(40、20、10 mg/kg)組，每組12只(n=12)；LP各組和順鉑組腹腔注射給藥治療，模型組腹腔注射給予等體積生理鹽水，每兩天一次，共5次。治療完成后觀察各組大鼠生存狀態(tài)及瘤體特征。

1.2.3 腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化的觀察 處死后剝?nèi)∧[瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，然后依次行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，然后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察并照相保存。

1.2.4 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測定 麻醉后取脾臟組織，行研磨勻漿并采用200目篩過濾以制備單細(xì)胞懸液，離心棄上清，加入10 mL NH4Cl、37℃水浴10 min，PBS溶液沖洗2次，加入適量培養(yǎng)液制備濃度為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后分別轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中(每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，n=6)，3孔加培養(yǎng)液100 μL PHA液(實(shí)驗(yàn)孔)，3孔加100 μL培養(yǎng)液(對(duì)照孔)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后滴加20 μL/孔 MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清并加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，采用自動(dòng)振蕩器振蕩處理10 min后采用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度(OD)，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)以反映脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：SI計(jì)算公式為：

1.2.5 血清中炎癥細(xì)胞因子水平的測定 麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心(1 500 rpm，10 min)后取血清，嚴(yán)格按照IL-2、TNF-α試劑盒操作說明進(jìn)行處理，然后通過酶標(biāo)儀測定各組大鼠血清中IL-2、TNF-α含量水平。

1.2.6 血液中CD4+、CD8+細(xì)胞百分率的測定及CD4+/CD8+比值的計(jì)算 麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心(10 000 rpm，5 min)后棄上清，PBS溶液沖洗2次，加乙醇(70%濃度，5 mL)混勻后于4℃環(huán)境放置48 h，傾去乙醇后經(jīng)PBS溶液沖洗2次，加水解酶RNase 5 μL(10 mg/mL)、37℃放置1 h后加入碘化丙啶(100 μg/mL)染液，室溫避光孵育30 min后通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+百分率，根據(jù)CD4+、CD8+百分率計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況及腫瘤特征

皮下注射接種卵巢癌NUTU-19細(xì)胞3天后，荷瘤大鼠出現(xiàn)皮毛松散、飲食狀況差，接種部位出現(xiàn)約0.4 cm×0.4 cm大小的腫瘤，瘤體呈現(xiàn)質(zhì)硬、活動(dòng)、與胸壁不粘連等典型特征。經(jīng)LP治療后，荷瘤大鼠皮毛松散、飲食狀況差等一般生存狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)；瘤體減小、活動(dòng)度和硬度降低，以LP 40 mg/kg組效果最為顯著。

2.2 各組大鼠荷腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化

模型組大鼠腫瘤組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見異常：細(xì)胞呈橢圓形，胞質(zhì)飽滿，胞核呈兩個(gè)或多個(gè)，核仁深染；LP(40、20、10 mg/kg)組和順鉑組腫瘤組織呈現(xiàn)細(xì)胞皺縮、數(shù)量減少、間隙增大、核染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)片狀壞死區(qū)，上述現(xiàn)象以LP 40 mg/kg組最為顯著(圖1)。

圖1 各組大鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化(HE 400×)Figure 1 The morphological changes of tumor tissue of the rats in each group(HE 400×)

2.3 各組大鼠瘤體重量及抑瘤率

與模型組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40、20 mg/kg)組和順鉑組瘤體重量顯著減輕、抑瘤率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，LP(10 mg/kg)組瘤體重量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，抑瘤率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與順鉑組相比發(fā)現(xiàn)，LP(40、20、10 mg/kg)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠瘤體重量及抑瘤率Table 1 The tumor weight and inhibitory rate of in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01.

2.4 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

與模型組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40、20 mg/kg)組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，順鉑組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與順鉑組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40 mg/kg)組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高(P<0.05)(表2)。

2.5 各組大鼠血清中炎癥因子水平

與模型組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40、20 mg/kg)組和順鉑組大鼠血清中IL-2、TNF-α含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與順鉑組比較，LP(40 mg/kg)組IL-2含量顯著降低(P<0.05)，TNF-α含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率Table 2 The spleen lymphocyte transformation rate of in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01；Compared with cisplatin group，▲P<0.05.

表3 各組大鼠血清中炎癥因子水平Table 3 The levels of inflammatory factors in rat serum in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01；Compared with cisplatin group，▲P<0.05.

2.6 各組大鼠血液中T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+百分率以及CD4+/CD8+比值

與模型組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40 mg/kg)組和順鉑組大鼠血液中CD4+百分率顯著升高(P<0.05)，LP(40、20 mg/kg)組和順鉑組CD8+百分率顯著降低(P<0.05，P<0.01)、CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與順鉑組比較發(fā)現(xiàn)，LP(40、20、10 mg/kg)組CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+比值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值Table 4 The present of CD4+，CD8+ in blood and the ratio of CD4+/CD8+ in each group

Note：Compared with model group，△P<0.05，△△P<0.01.

3 討論

婦科惡性腫瘤中卵巢癌發(fā)病率居第二位、致死率高居第一位[1]。目前，臨床上對(duì)于卵巢癌的治療主要以手術(shù)清除聯(lián)合術(shù)后化療為主，該治療方案能夠暫時(shí)清除并抑制腫瘤細(xì)胞生長，但3年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率高于50%，5年生存率不足30%，因此研發(fā)能夠有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以提高腫瘤患者生存率的新型藥物，仍是醫(yī)藥工作者亟需解決的臨床難題。

LP是一種類胡蘿卜素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立荷卵巢癌大鼠模型并給予LP干預(yù)，以順鉑為陽性對(duì)照藥物，研究發(fā)現(xiàn)LP能夠有效改善荷卵巢癌大鼠一般生存狀態(tài)、降低腫瘤組織活動(dòng)度和硬度，誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞壞死、減輕瘤體重量、提高抑瘤率，提示LP具有抑制荷卵巢癌大鼠腫瘤組織生長的作用。

脾臟組織是機(jī)體重要的的外周免疫器官，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化百分率是反映機(jī)體細(xì)胞免疫最基本的指標(biāo)[8]。IL-2是一種細(xì)胞因子，在惡性腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9]，Boyman等[10]和Gaffen等[11]研究發(fā)現(xiàn)IL-2具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫耐受的作用，其對(duì)免疫功能的影響與免疫細(xì)胞狀態(tài)和IL-2的濃度、作用時(shí)間等因素密切相關(guān)。張建武等[12]研究發(fā)現(xiàn)處于腫瘤、炎癥等病理狀態(tài)的機(jī)體內(nèi)TNF-α合成及分泌增加，而體內(nèi)TNF-α過量將抑制自身機(jī)體免疫功能，Anquetil等[13]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α影響免疫球蛋白IgG和lgM的生成并影響T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞正常的免疫反應(yīng)。CD4+分子和CD8+分子為兩種T淋巴細(xì)胞亞群，它們?cè)诩?xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著非常關(guān)鍵的作用[14]，Liu等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，CD4+/CD8+比值越高、機(jī)體免疫功能越好。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，荷卵巢癌大鼠經(jīng)腹腔注射給予LP治療后，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著提高，IL-2和TNF-α含量顯著降低，CD4+百分率提高、CD8+百分率降低而CD4+/CD8+比值顯著提高，提示LP具有提高荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用。

綜上所述，LP具有改善荷卵巢癌大鼠免疫功能的作用，表現(xiàn)出對(duì)腫瘤組織生長的抑制作用；其機(jī)制可能與LP能夠有效提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，降低IL-2和TNF-α含量水平，提高CD4+百分率、降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值有關(guān)。

1 Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer Statistics，2010[J].Ca Cancer Journal for Clinicians，2010，60(5)：277-300.

2 Karachaliou N，Pilotto S，Bria E，et al.Platelets and their role in cancer evolution and immune system[J].Transl Lung Cancer Res，2015，4(6)：713-720.

3 Codony-Servat J，Rosell R.Cancer stem cells and immunoresistance：clinical implications and solutions[J].Transl Lung Cancer Res，2015，4(6)：689-703.

4 De Stefani E，Boffetta P，Oreggia F.Plant foods and risk of laryngeal cancer：a case-control study in Uraguay[J].Int J cancer，2000，87：129-132.

5 Lin HY，Huang BR，Yeh WL，et al.Antineuroinflammatory effects of lycopene via activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase-α1/heme oxygenase-1 pathways[J].Neurobiol Aging，2014，35(1)：191-202.

6 Aydin S，Tokac M，Taner G，et al.Antioxidant and antigenotoxic effects of lycopene in obstructive jaundice[J].J Surg Res，2013，182(2)：285-295.

7 鄒黨華，譚布珍，黃艷琴，等.小劑量雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)荷卵巢癌大鼠體內(nèi)抑瘤作用的觀察[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，49(2)：110-111.

8 官佳懿，張永紅，崔德鳳，等.綠原酸對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖和分泌功能的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(29)：27-31.

9 陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：46-52.

10 Boyman O，Sprent J.The role of interleukin2 during homeostasis and activation of the immune system[J].Nat Rev Immunol，2012，12(3)：180-190.

11 Wang Z，Wang G，Zhu X，et al.Interleukin-2 is upregulated in patients with a prolapsed lumbar intervertebral disc and modulates cell proliferation，apoptosis and extracellular matrix metabolism of human nucleus pulposus cells[J].Exp Ther Med，2015，10(6)：2437-2443.

12 張建武，閔冬雨，周云，等.番茄紅素對(duì)H2O2致乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(12)：160-164.

13 Anquetil F，Clavel C，Offer G，et al.IgM and IgA rheumatoid factors purified from rheumatoid arthritis sera boost the Fc receptor-and complement-dependent effector functions of the disease-specific anti-citrullinated protein autoantibodies[J].J Immunol，2015，194(8)：3664-3674.

14 Xie J，Qiu ZF，Han Y，et al.The correlation between HLA-DR or CD38 expression in CD8(+)T cells and CD4(+)T cells count in treatment-naive HIV/AIDS patients[J].Zhonghua Nei Ke Za Zhi，2016，55(1)：36-39.

15 Liu YL，Wu YB，Zhai K，et al.Determination of interleukin 27-producing CD4 and CD8 T cells for the differentiation between tuberculous and malignant pleural effusions[J].Sci Rep，2016，6：19424-19428.

(收稿：2016-01-27)

The effects and mechanism of Lycopene on immune function of ovarian cancer rats

CHAIJingbo1，LIPing1，PEIZhiping2

1.Department of Obstetrics，The Second Hospital of Handan，Handan 056001，China；2.Department of General Surgery，The Second Hospital of Handan

Objective To investigate the effects of Lycopene(LP)on immune function of ovarian cancer rats′ and its mechanism.Methods Sixty ovarian cancer rat models made by injecting ovarian cancer cell line NUTU-19 were divided into five groups randomly：model group，Cisplatin group(2 mg/kg)and LP(40，20，10 mg/kg)group，n=12；the LP and Cisplatin were given by intraperitoneal injection，once every two days for 5 times.The rats general states and tumor growth conditions were observed，the tumor tissue morphological changes was observed by H&E staining；the tumor weight，inhibition rate，spleen lymphocyte transformation rate were detected；and the content of IL-2 and TNF-α in serum were detected.The present of CD4+，CD8+in blood were detected and the ratio of CD4+/CD8+was calculated.Results The food situation of the rats in LP groups was improved，tumor was reduced，activity and hardness were poorer，necrosis presented，tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared，especially the rats in LP 40 mg/kg group.Compared with model group，the tumor weight in LP(40，20 mg/kg)groups was decreased，the inhibition rate and the spleen lymphocyte transformation rate were increased；the contents of IL-2 and TNF-α were decreased；the CD8+present was decreased，while the CD4+present in LP 40 mg/kg group was increased，the ratio of CD4+/CD8+was increased.All of the difference above were significant(P<0.05，P<0.01).Conclusion LP can effectively improve the immune function of ovarian cancer rat；which perhaps relates to its effects of reducing the inflammatory cytokines levels and increasing the ratio of CD4+/CD8+.

Lycopene；Ovarian cancer；Rat；Immune function；Mechanism

1.邯鄲市第二醫(yī)院婦產(chǎn)科(邯鄲 056001)；2.邯鄲市第二醫(yī)院外一科

柴靜波，女，(1980-)，本科，主治醫(yī)師，從事婦產(chǎn)科疾病的研究。

柴靜波，E-mail：zqzhlx@126.com

R737.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.003