吳旖琦 劉 穎 趙 麗 金曉明

乙肝病毒蛋白和基因在肝內(nèi)和肝外膽管癌組織中的檢測(cè)及意義

吳旖琦1劉 穎2趙 麗3金曉明1

目的研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染與膽管癌(Cholangiocarcinoma，CC)的關(guān)系，并明確其與肝內(nèi)膽管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)發(fā)生的關(guān)系。方法 采用免疫組化、巢式PCR對(duì)52例CC(21例肝內(nèi)膽管癌和31例肝外膽管癌)石蠟包埋組織進(jìn)行HBV相關(guān)蛋白及基因的檢測(cè)。結(jié)果 21例ICC組織中HBsAg陽(yáng)性表達(dá)率為23.8%(5/21)，HBcAg陽(yáng)性表達(dá)率為19.0%(4/21)，HBV X 基因檢出率為33.3%(7/21)。在31例ECC組織中均未檢出HBsAg、HBcAg及HBV X基因。結(jié)論 HBV感染與ICC發(fā)生關(guān)系密切，但可能非ECC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。HBV X基因的整合可能參與肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的癌變過(guò)程。

膽管癌；乙型肝炎病毒；肝內(nèi)膽管癌；肝外膽管癌

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CC)是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)其在肝內(nèi)發(fā)生的部位不同可以分為肝內(nèi)膽管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)[1]。ICC和ECC在流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)及治療等方面均存在差異[2-3]。既往研究認(rèn)為CC的發(fā)生與原發(fā)性硬化性膽管炎、肝吸蟲病、肝內(nèi)膽管結(jié)石等相關(guān)[4-5]。最近國(guó)內(nèi)外相繼有報(bào)道指出乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染也是ICC發(fā)生的危險(xiǎn)因素[6-8]，但其是否與ECC發(fā)生相關(guān)的研究卻很少。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，HBV作為肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生的危險(xiǎn)因素已得到廣泛認(rèn)可。然而，HBV感染是否與ICC、ECC發(fā)生相關(guān)，其可能的機(jī)制如何，尚未得到深入研究。本研究通過(guò)檢測(cè)肝內(nèi)外膽管癌組織中HBV蛋白及基因，明確HBV感染與ICC和ECC發(fā)生的關(guān)系以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 52例CC(21例ICC和31例ECC)組織標(biāo)本，為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院及黑龍江省醫(yī)院2002—2008年間行手術(shù)切除的標(biāo)本。臨床資料顯示52例CC患者中，男性31例，女性21例，平均年齡57.59歲。血清HBsAg陽(yáng)性者16例(ICC為11例，占68.8%；ECC為5例，占31.3%，其中1例伴HBV和HCV的混合感染)，HBsAg陰性者36例。全部標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)。腫瘤位置：肝內(nèi)21例(5例為HCC和ICC的混合型)，肝外31例；隨機(jī)選取同期住院的非肝病患者49例作為對(duì)照組進(jìn)行臨床資料分析。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗HBsAg單克隆抗體、兔抗HBcAg多克隆抗體及S-P免疫組化二抗試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HBsAg及HBcAg蛋白的檢測(cè) 52例CC標(biāo)本常規(guī)切成4～5 μm厚石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)HBsAg及HBcAg蛋白的表達(dá)，檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明操作，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，微波抗原修復(fù)；山羊血清封閉后，滴加一抗(HBsAg 1∶100稀釋，HBcAg 1∶50稀釋)4℃ 16 h；滴加二抗室溫30 min后，滴加過(guò)氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封固。

免疫組化檢測(cè)結(jié)果判定：陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核或/和細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀。無(wú)棕黃色顆粒為陰性。

1.2.2 石蠟包埋組織HBV DNA 提取 52例CC組織無(wú)菌操作常規(guī)切片，切取10 μm厚切片，每2～4片放入一個(gè)1.5 mL滅菌EP管中。使用TAKARA公司DNA提取試劑盒，方法參照操作說(shuō)明進(jìn)行。滴加0.57 mL DEXPAT到裝有石蠟包埋組織的EP管，100℃加熱處理10 min。加熱后立即12 000 r/min，4℃離心10 min。移液器吸取水層。吸取的水層直接作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 巢式PCR擴(kuò)增HBV X基因 HBV X基因PCR引物：外套上游引物W1：5′-TGCCAACTGGATCCT TCGCGGGACGTCCTT-3′；外套下游引物W2：5′-GTTCACGGTGGT CTCCATG-3′；內(nèi)套上游引物N1：5′-GTCCCCTTCTTCATCTGCCGT-3′；內(nèi)套下游引物N2：5′-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3′。預(yù)計(jì)內(nèi)套引物擴(kuò)增片段為233 bp。引物由上海生工公司合成。第一輪PCR反應(yīng)體系：去離子水34.75 μL、PCR反應(yīng)緩沖液5 μL、dNTPs 4 μL、DNA模板5 μL、外引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸25 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取第一輪產(chǎn)物2 μL作模板，用內(nèi)套引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，58℃退火30 s、72℃延伸25 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。預(yù)計(jì)內(nèi)套引物擴(kuò)增片段為117 bp。PCR對(duì)照組：陽(yáng)性對(duì)照選取已證實(shí)的HBV X基因?yàn)殛?yáng)性的肝炎組織。選取血清HBV標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果均為陰性的11例肝臟組織作為陰性對(duì)照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)都是以率(%)的方式表示。兩組間的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CC組與對(duì)照組的臨床資料和危險(xiǎn)因素分析

52例CC組和49例對(duì)照組的臨床資料分析結(jié)果顯示，CC組HBsAg血清學(xué)陽(yáng)性病例為16例(30.8%)，對(duì)照組為2例(4.1%)，CC組高于對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。兩組間在年齡、性別、病史(肝硬化、肝吸蟲及慢性膽囊炎)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 CC組織中HBsAg、HBcAg的免疫組化檢測(cè)

免疫組化結(jié)果顯示，52例CC中，有5例ICC組織HBsAg陽(yáng)性表達(dá)，其中4例同時(shí)伴有HBcAg陽(yáng)性表達(dá)。HBsAg陽(yáng)性表達(dá)位于胞漿，呈棕黃色顆粒。HBcAg陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞核，胞漿僅有少量表達(dá)(圖1)。

2.3 CC組織中HBV X基因的檢測(cè)

巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，52例CC組織中HBV X基因檢出率為13.5%(7/52)，且均為ICC。X基因第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為233 bp；第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物在117 bp處可見(jiàn)陽(yáng)性條帶(圖2)。31例肝外膽管癌及11例陰性對(duì)照肝組織均未檢出HBV X 基因。

表1 CC組與對(duì)照組臨床資料和危險(xiǎn)因素的比較Table 1 Comparison of the clinical data and risk factors between CC and control cases

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CC組織中HBsAg、HBcAg表達(dá)Figure 1 Immunohistochemistry assay for HBs antigens，HBc antigens in CC tissues

圖2 巢式PCR檢測(cè)膽管癌組織中HBV X基因Figure 2 Nested-PCR detected HBV X gene in CC tissues

2.4 ICC與ECC臨床資料及HBV X基因和蛋白檢測(cè)結(jié)果的比較

21例ICC中，血清學(xué)和組織中HBsAg檢測(cè)陽(yáng)性分別為11例和5例，HBV X基因檢測(cè)陽(yáng)性為7例；31例ECC中，HBsAg血清學(xué)陽(yáng)性有5例，組織中HBV蛋白和基因的檢測(cè)均為陰性，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。ICC組和ECC組在性別、年齡和病史(肝吸蟲病史，慢性膽囊炎病史、肝硬化)方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌HBV感染和危險(xiǎn)因素的比較Table 2 Comparison of HBV infection and risk factors between ICC and ECC

3 討論

目前研究認(rèn)為，CC的發(fā)生與原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性膽石病、肝吸蟲病密切相關(guān)，但是，大部分CC的發(fā)生卻缺乏上述危險(xiǎn)因素[9-10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相繼有研究表明，HBV和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染也與CC的發(fā)生關(guān)系密切[11-14]。日本的一項(xiàng)研究顯示，600名HCV相關(guān)性肝硬化患者中，有2.3%的人可在7年后發(fā)展為膽管癌[15]。意大利Donato等的研究顯示，HCV感染為ICC發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而HBV感染與ICC發(fā)生無(wú)相關(guān)性[16]。而美國(guó)的一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，HBV感染是ICC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]。Peng等中國(guó)學(xué)者的研究認(rèn)為HBV與ICC的發(fā)生密切相關(guān)[18]。在本研究中，52例CC患者中血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性有16例(30.8%)，而HCV陽(yáng)性僅有1例(1.5%)，且同時(shí)合并HBV感染，提示HBV而非HCV與CC的發(fā)生密切相關(guān)。我國(guó)是HBV的高流行地域，而HCV的流行率則相對(duì)較低。因此，造成上述研究結(jié)果的不一致可能與不同國(guó)家肝炎病毒流行類型的差異有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實(shí)HBV的感染是否與ICC和ECC的發(fā)生都有關(guān)系，我們分別對(duì)21例ICC和31例ECC組織采用免疫組化和巢式PCR方法進(jìn)行HBV蛋白及X基因的檢測(cè)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21例ICC組織中有4例HBsAg、HBcAg蛋白均為陽(yáng)性表達(dá)，1例僅HBsAg蛋白表達(dá)陽(yáng)性；然而在31例ECC組織中則無(wú)此兩種蛋白的表達(dá)。基因檢測(cè)結(jié)果顯示，21例ICC有7例檢出HBV X 基因，而31例ECC組織未檢出X基因。上述結(jié)果證實(shí)，ICC組織中確實(shí)有HBV蛋白及基因的表達(dá)，這與Perumal等一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[19-20]。而在ECC組織中既無(wú)HBV蛋白又無(wú)X基因的表達(dá)，這說(shuō)明HBV感染可能是ICC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。由于膽管上皮細(xì)胞與肝細(xì)胞在胚胎發(fā)生上有同源性[21]，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞無(wú)論從形態(tài)學(xué)以及免疫組化特征上均與肝干細(xì)胞相類似[22]。因此現(xiàn)在普遍認(rèn)為HBV與ICC的發(fā)生可能與其致肝細(xì)胞癌的機(jī)制相似。本研究中，在ICC組織中檢測(cè)到HBV蛋白和X基因的表達(dá)，表明持續(xù)的HBV感染引起膽管上皮炎癥過(guò)程可能最終導(dǎo)致ICC的發(fā)生。此外，HBV X蛋白在體內(nèi)外都可抑制p53 基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，它還可使原癌基因激活[23]；HBV X基因還可通過(guò)順式激活hTERT 的mRNA引起膽道上皮細(xì)胞的增殖、分化和癌變[24]。上述機(jī)制可能都在HBV感染導(dǎo)致ICC發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。

本研究中，有6例血清學(xué)陽(yáng)性膽CC組織中未檢測(cè)到HBV蛋白，4例未檢測(cè)出HBV X基因，這種HBV表達(dá)在血清學(xué)和組織中檢測(cè)結(jié)果不一致的原因一方面可能由于HBV蛋白和基因在肝內(nèi)分布較局限，而手術(shù)切除標(biāo)本有限，未能取到具有代表性的組織；另一方面可能因?yàn)楦闻K體積較大，即使每個(gè)肝細(xì)胞分泌極少量病毒顆粒也能引起持續(xù)的毒血癥，但是組織中HBV蛋白的表達(dá)量很少，因而出現(xiàn)血清學(xué)HBV蛋白檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性而組織中蛋白表達(dá)為陰性。此外，7例HBV DNA陽(yáng)性ICC中有2例血清學(xué)HBsAg檢測(cè)為陰性，這部分患者可能為HBV隱匿性感染，即HBsAg的檢測(cè)為陰性，但肝臟組織中HBV DNA陽(yáng)性的個(gè)體[25]。上述HBV表達(dá)在血清學(xué)和組織中檢測(cè)結(jié)果不一致的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

通過(guò)對(duì)HBV DNA陽(yáng)性ICC患者臨床資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，7例ICC患者除2例有肝硬化病史，1例有吸煙飲酒史及1例有肝吸蟲病史外，其余3例均無(wú)其他疾病史，進(jìn)一步說(shuō)明HBV感染可能是ICC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染與ICC的發(fā)生密切相關(guān)，而與ECC無(wú)相關(guān)性，HBV感染可能是ICC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但是，由于本研究樣本數(shù)量有限，HBV感染與ICC發(fā)生的關(guān)系仍有待更進(jìn)一步研究證實(shí)。面對(duì)CC的高死亡率，需要更深入的研究HBV感染在ICC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。也許有效控制HBV感染能從根本上預(yù)防CC的發(fā)生。

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(收稿：2016-09-19)

Detection of hepatitis B virus protein and gene in intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma tissue

WUYiqi1，LUIYing2，ZHAOLi3，JINXiaoming1

1.Department of Pathology，Basic Medical Science College，Harbin Medical University，Harbin 150081，China；2.Department of Burn，Heilongjiang Province Hospital；3.Intensive Medicine，Harbin Children′s Hospital

Objective To investigate the importance of hepatitis B virus(HBV)infection in the pathogenesis of cholangiocarcinoma(CC)and further clarify the correlation between the occurrence of intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma.Methods HBV protein and gene of 52 formalin fixed，paraffin embedded tissues with CC were detected by immunohistochemistry and nest PCR.Results Hepatitis B virus X gene was detectable in 33.3%(7/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.Hepatitis B surface antigen(HBsAg)was detectable in 21.7%(5/21)and hepatitis B core antigen(HBcAg)was detectable in 19.0%(4/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.In contrast，no HBsAg，HBcAg and hepatitis B virus X gene were detected in any of the 31 extrahepatic cholangiocarcinoma cases.Conclusion HBV infection is a significant risk factor for intrahepatic cholangiocarcinoma，but not for extrahepatic cholangiocarcinoma，in Northeast of China.The integration of HBV gene may be involved in the carcinogenesis of intrahepatic bile duct epithelial cells.

Cholangiocarcinoma；Hepatitis B virus；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Extrahepatic cholangiocarcinoma

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(12541361)

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室(哈爾濱 150081)；2.黑龍江省醫(yī)院燒傷科；3.哈爾濱市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

吳旖琦，女，(1977-)，博士，副教授，從事消化系統(tǒng)腫瘤的研究。

金曉明，E-mail：jinxm55@163.com

R730.43

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.002