蔡杏華,巫 佳,林日輝,賀俊斌,武怡辰,王心雨

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室,廣西南寧 530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點實驗室,廣西南寧 530006；3.廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地，廣西南寧 530006)

草酸脫羧酶的修飾及其對草酸鈣的吸附研究

蔡杏華1,巫 佳1,林日輝2,3，*,賀俊斌1,武怡辰2,王心雨2

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室,廣西南寧 530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西高?；瘜W(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點實驗室,廣西南寧 530006；3.廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地，廣西南寧 530006)

為了提高草酸脫羧酶(OXDC)的適用性及其對草酸鈣的吸附性能,本實驗采用乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)對草酸脫羧酶進行了化學(xué)修飾,通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)測定其修飾位點,并研究和對比了酶在修飾前后對草酸鈣的吸附差異,采用動力學(xué)和熱力學(xué)吸附模型對吸附實驗的結(jié)果進行擬合分析。實驗結(jié)果表明,EDTAD成功修飾在草酸脫羧酶上,修飾位點位于肽N端的α-氨基上;且修飾酶(EDTAD-OXDC)對草酸鈣的吸附作用,在酶初始濃度為5 mg/mL,pH為7.0,溫度為37 ℃的條件下,比原酶(OXDC)提高了53.37%。結(jié)論:經(jīng)EDTAD修飾后的草酸脫羧酶，其穩(wěn)定性和吸附性能均有所提高。

草酸脫羧酶,乙二胺四乙酸二酐(EDTAD),修飾,草酸鈣結(jié)石,吸附

泌尿系統(tǒng)結(jié)石類疾病已成為當(dāng)今社會重要的健康問題之一,且患病率和復(fù)發(fā)率不斷地上升[1]。研究表明,13%的男性和7%的女性均有泌尿系統(tǒng)結(jié)石病的經(jīng)歷[2],且高達(dá)70%的患者治愈后有復(fù)發(fā)情況[3]。泌尿系統(tǒng)結(jié)石的成分約80%為草酸鈣結(jié)石[3-5],草酸鈣的化學(xué)存在形式有一水草酸鈣(COM),二水草酸鈣和三水草酸鈣,其中一水草酸鈣具有更為穩(wěn)定的熱力學(xué)形式[6]。草酸鈣結(jié)石的形成與高尿鈉、高尿鈣等密切相關(guān)[3],此外,糖尿病、高血壓等也與草酸鈣結(jié)石的形成有關(guān)[7-9]。

采用化學(xué)、物理和天然的方法預(yù)防和治療草酸鈣結(jié)石的效果并不盡人意[4],因為人體內(nèi)缺乏草酸代謝的酶類或相關(guān)代謝途徑,草酸代謝酶主要有草酸脫羧酶(EC,4.1.1.2 OXDC)、草酸氧化酶(OXO,EC 1.2.3.4)和草酰乙酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.8)三種[10]。Thalji等[11]發(fā)現(xiàn),向草酸鈣飽和溶液中添加200 mg的草酸脫羧酶可使草酸鈣的溶解度增加約15倍。Grujic等[12]給小鼠喂食草酸脫羧酶交聯(lián)晶體,可使小鼠尿液和糞便中的草酸濃度分別減少44%、72%,由此表明,草酸脫羧酶可治療高尿酸癥和結(jié)石病。而實際應(yīng)用中,酶制劑的濃度在泌尿系統(tǒng)的流動狀態(tài)下會被迅速稀釋,因此需尋求有效的方法或某種物質(zhì)對草酸脫羧酶進行修飾改性,提高其對草酸鈣的吸附性能。

賀俊斌等[13]發(fā)現(xiàn),EDTA可有效地吸附在一水草酸鈣上,而EDTA并無可與草酸脫羧酶發(fā)生修飾反應(yīng)的基團,因此本實驗采用EDTAD對OXDC進行修飾改性,并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)對修飾結(jié)果進行測定分析,同時對比了酶修飾前后對草酸鈣的吸附差異,為草酸脫羧酶的改性和應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草酸脫羧酶 基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a/YvrK,保存于本實驗室;甲酸脫氫酶(FDH)和胰蛋白酶(測序級) 美國Sigma公司;乙腈(色譜級) 美國Fisher Scientific公司;乙二胺四乙酸二酐(EDTAD) 天津希恩思生化科技有限公司;草酸鉀,甲酸鈉(色譜級),2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),聚乙二醇(PEG 20000) 北京索萊寶科技有限公司;β-NAD 上海楷洋生物技術(shù)有限公司。

CR-22G高速冷凍離心機 日本日立公司;液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀 美國Waters公司;1-13高速臺式離心機 美國Sigma公司;紫外可見分光光度計(TU-1901) 北京普析通用儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草酸脫羧酶的修飾 由實驗優(yōu)化出的最佳修飾條件,按照物質(zhì)的量比為nOXDC∶nEDTAD=1∶62,分別將原酶酶液和EDTAD加入到濃度為50 mmol/L,pH6.2的磷酸緩沖液(PBS)中,在30 ℃的恒溫?fù)u床中修飾反應(yīng)8 h,修飾反應(yīng)結(jié)束后,用透析袋(分子截留量為8000～12000)對修飾后的酶液在4 ℃下進行透析24 h,透析后的酶液用聚乙二醇(PEG,分子量為20000)對進一步濃縮,濃縮之后的酶液采用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜抽濾,所得酶液即為供實驗的修飾酶。

1.2.2 修飾率的測定 修飾率的測定采用TNBS法[14]。TNBS與酶蛋白表面的游離氨基發(fā)生反應(yīng),生成三硝基苯衍生物,在420 nm有特征吸收峰。原酶在420 nm的光吸收值記為A0,修飾酶的光吸收值記為A1,按下式計算修飾率:MR(%)=[1-(A1×C0)/(A0×C1)]×100。其中:C0、C1分別為修飾前原酶的濃度及修飾后經(jīng)透析濃縮所得酶的濃度。在檢測時,TNBS用雙蒸水稀釋至0.1%(w/v),以降低TNBS濃度過大對檢測結(jié)果的影響。實驗測得修飾酶的修飾率為75.25%±2%。

1.2.3 修飾位點的測定 酶解反應(yīng):分別取蛋白濃度均為2 mg/mL的原酶液和修飾酶液125 μL,各加50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)1 mL,按50∶1(w/w)的比例(酶液/TPCK-胰蛋白酶溶液)加入TPCK-胰蛋白酶溶液,混勻,37 ℃水浴保溫酶解12 h,取出,100 ℃水浴加熱15 min終止反應(yīng),12000 r/min離心5 min,收集上清液,4 ℃?zhèn)溆?進樣前用0.45 μm的針頭過濾器去除不溶物。另一組以不加原酶液和修飾酶液作為酶解空白。

UPLC條件:實驗使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng);色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm);柱溫為35 ℃;進樣體積為10 μL;以流速為0.3 mL/min,時間為0～40 min進行梯度洗脫(流動相A:0.1%(v/v)甲酸/水;流動相B:0.1%(v/v)甲酸/乙腈)。MS條件:聯(lián)用的質(zhì)譜儀為Waters XEVO G2-S QTOF;ESI+電離模式,毛細(xì)管電壓為2.7 kV,錐孔電壓為40 V,離子源溫度為100 ℃,脫溶劑氣溫度為350 ℃,錐孔反吹氣流量為20 L/Hr,脫溶劑氣流量為800 L/Hr,碰撞能為6 V,檢測器電壓為2575 V,掃描范圍為100～7000 m/z。

1.2.4 酶修飾前后的最適pH比較 在50 mmol/L pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的不同檸檬酸鹽緩沖體系中分別測定相同酶濃度的OXDC和EDTAD-OXDC的酶活力,以同組實驗中酶活力最高數(shù)據(jù)為100%酶活力,取平均值計算相對酶活。

1.3 吸附實驗

1.3.1 實驗設(shè)計 草酸鈣飽和溶液的制備,添加5 g一水草酸鈣晶體于500 mL錐形瓶內(nèi),加入250 mL蒸餾水,37 ℃條件下?lián)u床反應(yīng)1 d,反應(yīng)結(jié)束后將未溶解的一水草酸鈣晶體通過0.45 μm的微孔濾膜過濾,所得溶液則為草酸鈣飽和液。

實驗過程中為了消除酶活性對吸附過程的影響,草酸脫羧酶和修飾酶在100 ℃的條件下經(jīng)水浴滅活10 min。酶活的測定參考Svedruzic D等[15]的方法,其測定原理為:草酸鉀溶液在草酸脫羧酶的作用下生成甲酸,甲酸在甲酸脫氫酶條件下脫氫,脫下的氫與添加的β-NAD反應(yīng)生成DANH,NADH在340 nm光區(qū)下有特征吸收峰,通過測定其單位時間內(nèi)的吸光值變化以確定酶是否滅活徹底。

吸附體系設(shè)為2 mL,其中含草酸鈣飽和溶液、草酸脫羧酶或修飾酶,0.1 g一水草酸鈣晶體。反應(yīng)時間設(shè)為4 h,酶初始濃度的變化范圍為0.5～5.0 mg/mL,溶液的pH變化范圍在4.5～7.5之間(通過0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH),溫度變化范圍為25～40 ℃。反應(yīng)后的溶液通過孔徑為0.22 μm的針頭過濾器過濾。吸附量(qe)的計算方法如下:

表1 UPLC-MS分析結(jié)果Table 1 UPLC-MS analysis results

注:*為被EDTAD修飾的肽段。qe=V(C0-Ce)/S

式(1)

式中：C0- 酶的初始濃度(mg/mL);Ce-平衡時酶的濃度(mg/mL);V- 吸附體系的體積(mL);S(m2/g)-草酸鈣晶體的比表面積(參照何俊斌等[13]研究,S值為2.65 m2/g)。

1.3.2 分析測量 采用考馬斯藍(lán)染色法(又稱Bradford法)對酶的濃度進行測定,考馬斯亮藍(lán)G-250與酶蛋白反應(yīng)可生成在595 nm下有特征紫外吸收的絡(luò)合物,通過雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901)測量樣品在595 nm下的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.7259 x-0.0084(R2=0.9990)計算出酶的濃度。

1.3.3 吸附模型分析 在本實驗中,采用動力學(xué)模型(包括一級動力學(xué)、二級動力學(xué)和粒子內(nèi)擴散動力學(xué)模型)和熱力學(xué)模型對實驗數(shù)據(jù)進行擬合分析,所有參數(shù)和結(jié)果均通過origin(Pro9.0)軟件進行擬合處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾位點的測定結(jié)果

用TPCK處理過的胰蛋白酶對上述修飾酶進行酶解,其可專一性地水解酶中的賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)的羧基端。酶解樣品采用UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)分析,得到的總離子流圖經(jīng)waters公司的BiopharmaLynx軟件分析對比,結(jié)果表明:EDTAD修飾草酸脫羧酶的位點位于肽N端的α-氨基上,測定結(jié)果如表1所示,這與Gregg等[16]采用EDTAD修飾瘦素蛋白(rhu-met-leptin)得到的結(jié)果類似。

2.2 酶修飾后最適pH的變化

由圖1可知,原酶(OXDC)的最適pH為3.5,而修飾酶的最適pH為5.0。經(jīng)EDTAD修飾后,酶的最適pH向堿性方向偏移了約1.5個單位。這與Sangeetha 等[17]采用不同酸酐(檸康酸酐、鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐)修飾木瓜蛋白酶得到的的結(jié)果相類似。

圖1 OXDC和EDTAD-OXDC的最適pH比較Fig.1 Optimum pH of OXDC and EDTAD-OXDC

2.3 反應(yīng)時間對吸附過程的影響

如圖2所示,草酸脫羧酶和修飾酶對草酸鈣的吸附過程表現(xiàn)出了相同的吸附趨勢,修飾酶在吸附平衡后的吸附量比原酶約提高了4.6% 。以修飾酶的吸附曲線為例,在反應(yīng)達(dá)到4 h前,吸附量呈現(xiàn)快速上升的趨勢,4 h之后吸附量則呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢,并且在8 h左右逐漸達(dá)到吸附平衡狀態(tài),這可能是由于草酸鈣晶體能與酶結(jié)合的表面位點已逐漸達(dá)到飽和狀態(tài),剩余的部分結(jié)合位點由于酶分子間存在斥力而很難再占據(jù)草酸鈣表面的結(jié)合位點[13]。修飾酶在平衡時的吸附量(11.0921 mg/m2)比在0.5 h(10.0221 mg/m2)的吸附量約提高了8.8%,而與4 h時的吸附量(10.9723 mg/m2)相比僅提高了1.2%,由于反應(yīng)時間在4 h與12 h相比,其吸附量的提高很少,所以后續(xù)實驗的反應(yīng)時間均采用4 h。

圖2 反應(yīng)時間對吸附過程的影響 Fig.2 Effect of reaction time on adsorption process 注:酶濃度為1.5 mg/mL;溫度為37 ℃;pH為7.0。

2.4 吸附動力學(xué)

吸附動力學(xué)模型常被用于描述吸附過程中吸附質(zhì)在吸附劑上的吸附速率。在本實驗中,采用一級動力學(xué),二級動力學(xué)和粒子內(nèi)擴散動力學(xué)模型對實驗數(shù)據(jù)進行擬合分析。

當(dāng)一級動力學(xué)模型被用于預(yù)測吸附動力學(xué)時,其方程為[18]:

qt=qe(1-e-k2t)

式(2)

轉(zhuǎn)化為線性形式可表示為:

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

式(3)

式中：qe-平衡時的吸附量(mg/m2)；qt-任意時間點的吸附量(mg/m2)；k1-一級動力學(xué)反應(yīng)的吸附速率常數(shù)；t-吸附過程的反應(yīng)時間(h)。

以ln(qe-qt)為縱坐標(biāo),時間(t)為橫坐標(biāo),實驗結(jié)果由origin軟件擬合分析,擬合結(jié)果如圖3所示。

圖3 一級動力學(xué)模型擬合結(jié)果 Fig.3 Pseudo-first-order kinetic fit for the adsorption

二級動力學(xué)模型,方程式為[19]:

式(4)

轉(zhuǎn)化為線性形式時:

式(5)

以t/qt為縱坐標(biāo),時間(t)為橫坐標(biāo),擬合結(jié)果如圖4所示:

表2 草酸脫羧酶及其修飾酶的動力學(xué)參數(shù) Table 2 Kinetic parameters of the OXDC and EDTAD-OXDC

表3 酶初始濃度對吸附過程的影響Table 3 Effect of initial enzyme concentration on the adsorption process

圖4 二級動力學(xué)模型擬合結(jié)果 Fig.4 Pseudo-second-order kinetic fit for the adsorption

注:溫度為37 ℃;pH為7.0,時間4 h。為了考察其動力學(xué)機制對吸附過程的影響,粒子內(nèi)擴散模型同時用于對吸附過程的分析[20],其方程式可表示為:

qt=kidt0.5+Ci

式(6)

式中：kid-粒子內(nèi)擴散速率常數(shù)；Ci-邊界層厚度的相關(guān)系數(shù)；t-吸附過程中的反應(yīng)時間(h)。

如果吸附過程只是發(fā)生粒子內(nèi)的擴散,那么qt對t0.5的線性擬合曲線應(yīng)該經(jīng)過原點,否則,其他的作用機制和粒子內(nèi)擴散都可能同時存在[21]。

圖5 粒子內(nèi)擴散模型的擬合結(jié)果 Fig.5 Intraparticle diffusion model fit for the adsorption

方程式(2)、式(3)、式(4)、式(5)、式(6)中所有的動力學(xué)參數(shù)分別由圖3～圖5中曲線的斜率和截距計算得出,各動力學(xué)參數(shù)的擬合值如表2所示。表2的擬合結(jié)果表明,由二級動力學(xué)模型擬合出原酶的R2值(0.9994)和修飾酶的R2值(0.9988)都大于0.99,且均大于一級動力學(xué)和粒子內(nèi)擴散模型的R2值。此外,理論計算值qcal(10.4529,10.8868 mg/m2)和實驗真實值qexp(10.4401,10.9723 mg/m2)也比較吻合,所以二級動力學(xué)模型更適用于描述草酸脫羧酶及其修飾酶對草酸鈣的吸附過程。粒子內(nèi)擴散模型的擬合結(jié)果顯示其R2值(0.8962,0.8396)相關(guān)性較差,并且擬合曲線也沒有經(jīng)過零點,表明此模型不適合于分析此吸附過程。

2.5 不同的酶初始濃度對吸附過程的影響

如表3所示,隨著酶初始酶濃度增加(0.5～5.0 mg/mL),兩種酶對草酸鈣的吸附量都呈現(xiàn)上升的趨勢,然而修飾酶的增加趨勢比原酶更明顯,并且隨著酶初始濃度的升高,修飾酶對草酸鈣的吸附量和原酶相比差距逐漸增大,在酶初始濃度為5.0 mg/mL,溫度為37 ℃,pH為7.0的條件下,修飾酶對草酸鈣的吸附量比原酶提高了53.37%。

出現(xiàn)此類現(xiàn)象的原因可以歸為三點。首先,隨著溶液中酶濃度的增加,液體體積之間的傳質(zhì)推動力隨之上升。其次,酶的擴散系數(shù)還與其濃度的增加正相關(guān)。最后,草酸鈣表面的酶分子隨著平衡時溶液中酶濃度的增加而增加[22-23]。

2.6 反應(yīng)溫度對吸附過程的影響

原酶和修飾酶對草酸鈣的吸附趨勢如圖6所示。當(dāng)溫度逐漸上升時(25～40 ℃),原酶和修飾酶都呈現(xiàn)上升的趨勢,并且修飾酶的吸附量高于原酶。由此表明此吸附過程是一個吸熱的過程。

表4 原酶與修飾酶的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters of the OXDC and EDTAD-OXDC

圖6 反應(yīng)溫度對吸附過程的影響 Fig.6 Effect of temperature on the adsorption process注:濃度為1.0 mg/mL;pH為7.0;時間4 h。

2.7 吸附熱力學(xué)模型

吸附熱力學(xué)模型常被用于分析溫度對吸附過程的影響,其方程式可表示為:

Kc=CAE/Ce=(C0-Ce)/Ce

式(7)

式中：Kc-吸附平衡常數(shù)；CAE-吸附平衡時酶的吸附量；C0-酶的初始濃度(mg/mL);Ce-平衡時酶的濃度(mg/mL)。

熱力學(xué)參數(shù):吉布斯自由能ΔG0(kJ/mol)、焓變ΔH0(kJ/mol)和熵變ΔS0(J/mol/K)等的計算如下:

ΔG0=-RTlnKc

式(8)

ΔG0=ΔH0-TΔS0

式(9)

式(10)

R是氣體常數(shù)(8.314 J/mol/K);T為開爾文(K)溫度;ΔH0和ΔS0的值通過圖8(范托夫圖)中的斜率和截距計算得出;ΔG0的值由式(8)計算得出。各熱力學(xué)參數(shù)的擬合結(jié)果如表4所示。

圖7 溫度影響的擬合結(jié)果 Fig.7 Fitting results of temperature effects

圖8 范托夫圖對吸附過程的擬合結(jié)果Fig.8 Fitting results of the Van’t Hoff plot for the adsorption

圖9 反應(yīng)的pH對吸附過程的影響 Fig.9 Effect of pH on the adsorption process注:體系為5 mL(便于pH的調(diào)節(jié));濃度為0.5 mg/mL;溫度為37 ℃;時間4 h。

表4的結(jié)果顯示,ΔG0的值在四個溫度下均為負(fù)值,這表明整個吸附過程是可自發(fā)進行的;ΔH0均為正值,表明此吸附過程是吸熱過程,溫度的升高有利于吸附的進行;ΔS0的值為正值則表明體系的復(fù)雜程度不斷增加。

2.8 反應(yīng)pH對吸附過程的影響

如圖9所示,草酸脫羧酶和修飾酶表現(xiàn)出了相似的吸附趨勢,隨著溶液中的pH從4.5增加到7.5,兩種酶的吸附量都呈現(xiàn)先下降再回升的趨勢,當(dāng)pH約為5.0時原酶的吸附量處于最低點,而當(dāng)pH約為6.0時,修飾酶的吸附量則處于最低點;根據(jù)于俊杰等[24]的研究,草酸脫羧酶的等電點約為5.1,一水草酸鈣的零電荷點約為2.92[25]。因此推測認(rèn)為,當(dāng)溶液的pH在等電點附近,草酸脫羧酶表面的靜電荷接近于零,與非等電點相比其吸附性能下降。當(dāng)溶液pH在3.0～5.0之間,草酸鈣的表面帶負(fù)電荷而草酸脫羧酶的表面帶正電荷,與溶液的pH在5.0～7.5之間(兩者都帶負(fù)電)相比,其更有利于酶對草酸鈣的吸附。對于修飾酶,其吸附量在pH接近6.0時處于最低點。之前的實驗研究發(fā)現(xiàn),草酸脫羧酶與EDTAD發(fā)生修飾反應(yīng)后,其最適反應(yīng)pH提高了1.5個單位,結(jié)合圖9的實驗結(jié)果,認(rèn)為修飾酶的等電點同時也發(fā)生了變化,因此當(dāng)溶液的pH在6.0附近時其吸附量處于最低點。

3 結(jié)論

乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)成功地共價修飾在草酸脫羧酶上,修飾位點位于肽N端的α-氨基上。

在酶初始濃度為5.0 mg/mL,pH為7.0和溫度為37 ℃的條件下,修飾酶對草酸鈣的吸附量比原酶提高了53.37%。這表明修飾酶后的草酸脫羧酶吸附性能更強。

對比兩種酶的吸附特征表明,隨著酶初始濃度和溫度的上升,兩者對草酸鈣的吸附量都呈現(xiàn)上升的趨勢;隨著溶液的pH在從4.5上升至7.5,兩種酶的吸附量呈現(xiàn)出先下降后回升的趨勢,當(dāng)pH接近等電點時吸附量最低。

一級動力學(xué)、二級動力學(xué)和粒子內(nèi)擴散動力學(xué)模型對實驗的分析結(jié)果表明,二級動力學(xué)更適合于描述和分析整個吸附過程。熱力學(xué)參數(shù)ΔG0、ΔH0和ΔS0的值表明,草酸脫羧酶對草酸鈣的吸附是可行的、自發(fā)的和吸熱的過程。

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Research on the adsorption of the modified oxalate decarboxylase on calcium oxalate

CAI Xing-hua1,WU Jia1,LIN Ri-hui2,3,*,HE JUN-bin1,WU Yi-chen2,WANG Xin-yu2

(1.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources, College of Marine Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities,Nanning 530006,China; 2.Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process, School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University for Nationalities,Nanning 530006,China; 3.Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification,Guangxi University for Nationalities,Nanning 530006,China)

In order to improve the applicability and adsorption property of oxalate decarboxylase(OXDC)on calcium oxalate. EDTAD was used to modify the OXDC,modified site was determined by UPLC-MS,and the adsorption of the enzymes on calcium oxalate(CaOx)were studied and compared. The kinetics and thermodynamics adsorption models were used to fit and analysis the experimental data. Results showed that EDTAD was successfully grafted onto OXDC covalently as an absorption group,the modified sites were located in theα-NH2of the peptide N side,and the adsorption property of the modified enzyme(EDTAD-OXDC)on calcium oxalate was 53.37% higher than that of OXDC in initial enzyme concentration of 5 mg/mL,pH7.0,temperature of 37 ℃. Conclusion:which inclicated the stability and adsorption properties of DXDC was improved by grafting with EDTAD.

oxalate decarboxylase;EDTAD;modified;calcium oxalate stones;adsorption

2016-09-12

蔡杏華(1992-),男,碩士研究生,主要從事草酸脫羧酶的修飾改性研究,E-mail:m18007804069@163.com。

*通訊作者:林日輝(1972-),男,博士,研究員,主要從事蛋白質(zhì)與酶工程方面研究，E-mail:rihuilin@aliyun.com。

國家教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目(教外司留[2012]1707號);廣西自然科學(xué)基金項目(2014GXNSFAA118045);廣西高等教育機構(gòu)人才小高地創(chuàng)新團隊計劃(GJR201147)資助;廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(桂科合14125008-1-2);2015年廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助研究生科研創(chuàng)新項目(YCSZ2015129)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0111-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.013