卜文婕,李 艷,童 麗,楊建課,孫 敏,*

(1.皖南醫(yī)學院醫(yī)學生物學教研室,安徽蕪湖 241002；2.安徽大學生命科學學院,安徽合肥 230601；3.青海大學醫(yī)學院中藏藥研究中心,青海西寧 810001)

不同食用油脂對大鼠胰島素抵抗和糖異生的影響

卜文婕1,2,李 艷2,童 麗3,楊建課1,孫 敏2,*

(1.皖南醫(yī)學院醫(yī)學生物學教研室,安徽蕪湖 241002；2.安徽大學生命科學學院,安徽合肥 230601；3.青海大學醫(yī)學院中藏藥研究中心,青海西寧 810001)

目的:比較不同油脂對SD大鼠胰島素抵抗和糖異生的影響。方法:將雄性SD大鼠以7只為一組分為4組,對照組食用基礎飼料,豬油、橄欖油和油茶籽油組大鼠食用含相應油脂高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng)17周,處死前進行口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰島素耐量實驗(ITT),大鼠取血處死后,取血清檢測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)和脂聯(lián)素的水平,計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),并采用Real time PCR技術檢測大鼠肝臟中糖異生相關基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)的mRNA表達。結(jié)果:各油脂組大鼠表現(xiàn)出不同程度的胰島素抵抗(IR),豬油組大鼠FPG、FINS和HOMA-IL均顯著升高(p<0.05),OGTT和ITT異常,血清脂聯(lián)素明顯降低(p<0.05),而橄欖油和油茶籽油組大鼠IR程度顯著低于豬油組(p<0.05),油茶籽油組脂聯(lián)素水平明顯高于豬油組(p<0.05)。糖異生相關基因中,各油脂組大鼠PEPCK和G6P表達量均升高(p<0.05),其中豬油組明顯高于其他組(p<0.05),橄欖油組和油茶籽油組與正常組間差異較小,但存在統(tǒng)計學意義(p<0.05)。結(jié)論:富含飽和脂肪酸(SFA)的豬油可增加產(chǎn)生IR的風險,而不飽和脂肪酸(UFA)豐富的橄欖油和油茶籽油誘導大鼠IR程度明顯低于豬油組,有統(tǒng)計學意義(p<0.05),其中油茶籽油作為我國特產(chǎn)油脂,可作為優(yōu)質(zhì)油脂進行食用。

食用油,胰島素抵抗,脂聯(lián)素,糖異生

《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告》表明,我國城市居民超重肥胖問題凸顯,脂肪攝入量過多,平均膳食脂肪供能比超過30%[1],機體脂肪酸的攝取主要依靠人們?nèi)粘Ｉ钪械氖秤糜椭瑵M足的,但是過食和不適當食用油脂會導致肥胖,從而導致胰島素抵抗(IR)的發(fā)生。目前對IR發(fā)生的機制研究眾多,但其具體機制尚無明確定論,其中脂肪細胞因子脂聯(lián)素越來越受人們重視,其影響胰島素敏感性的分子機制非常復雜,本文通過對不同的食用油脂(富含飽和脂肪酸的豬油以及富含不飽和脂肪酸的橄欖油和油茶籽油[2])引起大鼠IR程度的比較,從脂聯(lián)素與糖異生關系的角度出發(fā),來探究產(chǎn)生IR的原因,同時為食用油的選擇提供一定的依據(jù)。其中油茶籽油作為我國特產(chǎn)油脂,其保健作用越來越受人們重視,文章從IR水平探討了油茶籽油作為優(yōu)質(zhì)食用油的可能性。

表1 Real time PCR引物序列Table 1 The primers of real time PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用油 豬油,臨沂新程金鑼肉制品集團有限公司;橄欖油 益海嘉里投資有限公司;油茶籽油 安徽龍眠山食品有限公司;基礎飼料 安徽醫(yī)科大學實驗動物中心;胰島素 諾和諾德制藥有限公司;葡萄糖、超靈敏胰島素ELISA試劑盒 瑞典Mercodia公司;脂聯(lián)素ELISA試劑盒 EMD 美國Millipore公司;總RNA提取試劑盒 上海賽百盛公司;Real Time PCR試劑盒 北京全式金公司;穩(wěn)豪型血糖試紙 強生(上海)醫(yī)療器械有限公司；SPF級雄性SD大鼠,4周齡,體重(70±10) g 安徽醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗動物合格證號:皖醫(yī)動準字01號;本次實驗所用高脂飼料的配方比例 基礎飼料占71.95%,食用油占10%,奶粉占2.5%,糖占5%,蛋黃占10%,膽固醇占0.5%,膽酸鈉占0.05%。

One Touch血糖儀 美國強生Lifescan公司;多功能酶標儀 瑞士Tecan公司;電動勻漿器 寧波新芝生物科技股份有限公司;全自動生化分析儀 德國西門子公司;PCR擴增儀 美國伯樂公司;熒光定量PCR儀器 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)方法 大鼠在光/暗周期12 h/12 h,室內(nèi)溫度(25±0.5) ℃適應性飼養(yǎng)7 d,適應期后隨機進行分組,分別是:對照組、豬油組、橄欖油組和油茶籽油組,自由飲食飲水,對照組喂食基礎飼料,各油脂組喂食相應油脂的高脂飼料,持續(xù)飼養(yǎng)17周。

1.2.2 口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰島素耐量(ITT)實驗 在大鼠處死前一周內(nèi)進行OGTT和ITT實驗,方法如下:

OGTT實驗:將飼養(yǎng)大鼠饑餓10 h后,用血糖儀進行血糖檢測。然后以2.5 g/kg劑量的葡萄糖溶液進行灌胃,以空腹血糖作為0 min血糖值,分別測30、60、120和180 min處血糖值。ITT實驗:取OGTT實驗2 d后的大鼠進行胰島素耐量實驗,用血糖儀進行血糖檢測,接著對大鼠進行腹腔注射胰島素,劑量為0.75 U/kg,以空腹血糖作為0 min血糖值,測定30、60、90和120 min處的血糖值。

1.2.3 胰島素抵抗相關指標 大鼠饑餓過夜后麻醉,腹主動脈取血處死,分離血清,并取肝臟組織于液氮中保存待用。使用全自動生化分析儀檢測血清中空腹血糖(FPG)含量,使用超靈敏胰島素ELISA試劑盒檢測大鼠血清的胰島素水平,相關檢測方法參考試劑盒說明書。

胰島素抵抗指數(shù)[3](HOMA-IR指數(shù))=[空腹胰島素(國際單位/升)×空腹血糖(mmol/L)]/22.5

1.2.4 血清中脂肪細胞因子脂聯(lián)素的檢測 使用脂聯(lián)素ELISA試劑盒檢測大鼠血清脂聯(lián)素水平,相關檢測方法參考試劑盒說明書。

1.2.5 肝臟糖異生相關基因的檢測 依照總RNA提取試劑盒(提供的試劑和方法提取大鼠肝臟組織總RNA,取總RNA進行DNA酶解純化后反轉(zhuǎn)錄成cDNA(20 μL體系),以cDNA為模板進行real time PCR檢測,PCR擴增條件:預變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 1 min,所有基因均為40個循環(huán)。使用ABI實時定量PCR儀檢測糖異生相關代謝基因,基因及內(nèi)參的上下游引物見表1。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,作圖工具為Graphpad 5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油脂對SD大鼠OGTT和ITT的影響

如圖1所示,在口服葡萄糖30 min后各組血糖均升高,其中豬油組上升最高,但各組間差異性較小(p>0.05),60 min后,豬油處理組大鼠血糖值顯著高于其他組(p<0.05),橄欖油處理組大鼠60 min后基本恢復血糖,油茶籽油處理組大鼠與對照組間無明顯差異(p>0.05)。圖2所示,ITT實驗中,各組在注射胰島素后血糖均下降,其中對照組大鼠血糖下降最快,其次是油茶籽油組,豬油與橄欖油組大鼠血糖降低緩慢。對照組和油茶籽油組大鼠均在60 min時降到最低,60 min時對照組顯著高于豬油處理組(p<0.05),橄欖油和油茶籽油組大鼠與對照組間無顯著性差異(p>0.05)。橄欖油組和豬油組大鼠在90 min時下降到最低,其他組血糖值均有所回升,各組間在90 min和120 min時無顯著差異(p>0.05),結(jié)果提示豬油組胰島素耐量異常,胰島素不敏感,表明有IR產(chǎn)生,橄欖油組IR程度比豬油組低,油茶籽油組與對照組大鼠的血糖值在各時間點都差異不顯著(p>0.05)。

表3 不同油脂對SD大鼠血清脂聯(lián)素的影響

圖1 不同油脂對SD大鼠OGTT的影響Fig.1 The influence of different oils

圖2 不同油脂對SD大鼠ITT的影響Fig.2 The influence of different oils

2.2 不同油脂對SD大鼠IR相關指標的影響

由表2可知,豬油組大鼠血糖值最高,與正常對照組有顯著差異(p<0.05),橄欖油組與油茶籽油組大鼠與對照組間均無顯著差異(p>0.05);喂食油脂的各組大鼠的胰島素水平顯著高于對照組(p<0.05),其中橄欖油組與油茶籽油組低于豬油組,有統(tǒng)計學意義(p<0.05);各油脂組HOMA-IR水平均上升,橄欖油和油茶籽油組大鼠顯著低于豬油組(p<0.05),但高于對照組大鼠水平,有統(tǒng)計學差異(p<0.05),其中油茶籽油組的HOMA-IR水平與對照組水平最接近。

組別FPG(mmol/L)FINS(μg/L)HOMA-IR對照組561±040050±005##309±022##豬油組661±074?271±021??1966±221??橄欖油組617±059068±006?##462±044???##油茶籽油組567±033065±015?##398±023??##

注:*:與對照組比較,p<0.05;**:與對照組比較,p<0.01;#:與豬油組比較,p<0.05;##:與豬油組比較,p<0.01;表3、圖3同。

2.3 不同油脂對SD大鼠血清脂聯(lián)素的影響

由表3可知,與對照組相比,各組大鼠血清脂聯(lián)素水平較對照組均降低(p<0.05),橄欖油組和油茶籽油組水平相對豬油組有一定升高,其中油茶籽油組顯著高于豬油組(p<0.05),有統(tǒng)計學意義。

2.4 不同油脂對SD大鼠糖異生相關基因表達的影響

如圖3所示,豬油組大鼠肝組織中PEPCK水平相較于其他各組,表達量最高(p<0.05);橄欖油和油茶籽油組相對較低,均顯著高于對照組(p<0.05)。各油脂組大鼠的G6Pase水平均顯著高于對照組(p<0.05),其中橄欖油和油茶籽油組表達量低于豬油組大鼠,有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

圖3 不同油脂對SD大鼠糖異生相關基因表達的影響Fig.3 The influence of different oils

3 討論與結(jié)論

IR是指使正常劑量的胰島素所產(chǎn)生的效應降低,機體對胰島素的反應性降低,從而引起β細胞代償性分泌增加的一種現(xiàn)象[4]。研究表明,長期的高脂飲食可導致IR產(chǎn)生,表現(xiàn)為靶組織對胰島素敏感性降低,空腹胰島素水平增加[5]。本實驗中各油脂處理組大鼠已經(jīng)存在不同程度的IR,FIN上升,HOMA-IR值相應升高,證明過度食用油脂可引起IR,但FPG水平只在豬油組大鼠中升高,OGTT和ITT實驗也表明豬油組大鼠胰島素敏感性最低,說明長期食用高SFA的油脂比食用高UFA的食用油脂更易誘導IR產(chǎn)生。不同的脂肪酸對IR的影響機制尚不明確,可能是通過結(jié)合到胰島素敏感組織(如肝臟),脂肪酸再進一步影響細胞膜的離子通透性以及相關信號傳導改變胰島素受體的親和力,從而改變胰島素敏感性。

肝臟是糖脂代謝的主要臟器,也是IR最先發(fā)生的外周靶器官,肝臟IR主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出的能力減弱,肝臟葡萄糖輸出主要包括糖異生和糖原分解[6]。因此肝臟糖異生紊亂是IR產(chǎn)生的重要誘因。其中PEPCK和G-6-Pase是糖異生的限速酶,其轉(zhuǎn)錄的多少,決定著糖異生的速度。脂聯(lián)素被認為是一種抗糖尿病的脂肪細胞因子,對肝臟糖脂代謝起調(diào)控作用[7]。有研究指出[8],脂聯(lián)素能夠發(fā)揮抗糖尿病的作用是由于能夠抑制糖異生,但抑制糖異生的機制目前尚不明確。本實驗結(jié)果表明,食用富含SFA油脂的大鼠相較于食用UFA油脂大鼠更能引起機體IR產(chǎn)生,可能是由于降低了機體脂聯(lián)素水平,從而增加了糖異生程度,表現(xiàn)為糖異生相關基因的表達量改變,IR程度的加深進一步降低脂聯(lián)素水平,這二者間的互為因果關系也被相關文章提起過[9]。

綜上所述,長期食用SFA豐富的油脂,更易引起胰島素敏感性的降低,導致IR增加和脂聯(lián)素水平的下降,二者相平行。IR的增加降低脂聯(lián)素水平,脂聯(lián)素水平的降低可增加糖異生,從而進一步導致IR的產(chǎn)生,而食用富含UFA的橄欖油和油茶籽油能夠改善上述代謝紊亂現(xiàn)象,特別是油茶籽油,是中國特有的食用油脂,更加適合作為日常油為人們食用。

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Effect of different oil on insulin resistance and gluconeogenesis in rats

BU Wen-jie1,2,LI Yan2,TONG Li3,YANG Jian-ke1,SUN Min2,*

(1.Department of Medical Biology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China；2.School of Life Science,Anhui University,Hefei 230601,China；3.Traditional Chinese Medicine and Tibetan Medicine Research Center ofMedical College of Qinghai University,Xining 810001,China)

Objective:To compare the effects of different oil on insulin resistance and gluconeogenesis in SD rats. Methods:Male SD rats were divided into four groups(n=7). Rats in the control group were fed normal diet and the high fat diet groups were fed with diet containing different oil(lard,olive,and camellia seeds oil). Rats were fed for 17 weeks. Oral glucose tolerance test(OGTT)and insulin tolerance test(ITT)were performed before sacrificed. The artery blood samples were collected after anesthesia,then serum were separarted to detect the levels of fasting plasma glucose(FPG),fasting serum insulin(FINS)and adiponectin. The mRNA expression of phosphoenolpyruvate carboxykinas(PEPCK)and glucose-6-phosphatase(G6P)related to gluconeogenesis in liver,were analyzed by real time PCR. Results:Rats in each oil-fed group showed different levels of insulin resistance. Lard-fed rats led to the significantly increased in levels of FPG,FINS and HOMA-IR(p<0.05),impaired OGTT and ITT performance. The level of serum adiponectin was decreased in lard-fed rats compared with others(p<0.05). The expression of gluconeogenesis-related genes(PEPCK and G6Pase)in all oil-fed rats were higher than those in control group(p<0.05). The mRNA expression in lard-fed rats were significantly higher than other groups(p<0.05). Olive oil and camellia seeds oil-fed rats showed little difference compared with the normal group,but there was statistical significance(p<0.05). Conclusion:Lard riched in saturated fatty acids(SFA)may increase the risk of IR. The olive and camellia seeds oil,which have great amount of unsaturated fatty acids(UFA),induced significantly lower degree of IR than lard(p<0.05).Camellia seed oil as a characteristic oil in China,can be used as a high quality oil.

oil;insulin resistance;adiponectin;gluconeogenesis

2016-09-09

卜文婕(1989-),女,助理實驗師,主要從事功能油脂與代謝疾病和細胞生物學相關研究,E-mail:buwj611@163.com。

*通訊作者:孫敏(1970-),女,博士,副教授,主要從事代謝相關疾病研究,E-mail:sm3216@126.com。

青海省重點研發(fā)與轉(zhuǎn)化計劃項目(2016-SF-126);國家自然基金面上項目(31670361);皖南醫(yī)學院重點科研項目培育基金(WK2015Z04)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)07-0361-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.061