李小旭，劉 侃，張小琴，郝葆青*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川 汶川 623002）

牦牛隱性乳房炎病原菌的分離及鑒定

李小旭1，劉 侃1，張小琴2，郝葆青1*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川 汶川 623002）

牦牛隱性乳房炎被認(rèn)為是高原藏族地區(qū)牦牛奶產(chǎn)量低下的主要原因之一。探索和研究牦牛隱性乳房炎致病菌特性及流行病學(xué)特征，可為牦牛隱性乳房炎防治提供一定的依據(jù)。本試驗(yàn)采集了紅原地區(qū)不同牧群牦牛的80份奶樣，由體細(xì)胞數(shù)、pH值測(cè)定初步篩選出了30份疑似牦牛乳房炎奶樣，然后對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)觀察及生化檢測(cè)，分離并鑒定出了牦牛隱性乳房炎病原菌。結(jié)果顯示：80份奶樣中有28份為牦牛隱性乳房炎奶樣，檢出率為35%；細(xì)菌學(xué)檢測(cè)表明，28份奶樣中金黃色葡萄球菌占10.71%，無乳鏈球菌占25%，乳房鏈球菌占32.14%，停乳鏈球菌占17.86%，大腸桿菌占14.29%。

牦牛；隱性乳房炎；病原菌；奶樣；分離；鑒定

本試驗(yàn)采集了四川省紅原藏族地區(qū)的三個(gè)牦牛群的奶樣，通過初步篩選后，在實(shí)驗(yàn)室對(duì)疑似牦牛乳房炎奶樣分別進(jìn)行了乳汁微生物學(xué)檢測(cè)和生化鑒定，分離和檢測(cè)出了引起該地區(qū)牦牛群隱性乳房炎的各種病原菌，并對(duì)其特性及流行特征進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)材料

1.1 奶樣 80份奶樣采自紅原縣龍日壩三個(gè)牦牛群中無明顯臨床型乳房炎特征的泌乳期牦牛。采樣時(shí)用溫水清洗乳房，75%酒精消毒乳頭，棄掉頭2～3把奶。每頭采奶樣10mL于滅菌離心管中，加蓋封緊，標(biāo)明牛號(hào)和日期，用液氮罐保存帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 儀器及設(shè)備 顯微鏡、高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、接種環(huán)、平皿、試管等。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 小牛血清肉湯、普通瓊脂平板、血瓊脂平板和斜板、兔鮮血瓊脂平板、麥康凱平板、七葉苷血瓊脂培養(yǎng)基、馬尿酸鈉培養(yǎng)基等，各種培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制[1]。試劑有草酸銨結(jié)晶紫、盧氏碘液、95%乙醇、番紅復(fù)染液。

2 試驗(yàn)方法

2.1 乳汁pH值檢測(cè) 乳汁pH值檢測(cè)用麝香草酚蘭檢驗(yàn)法（BTB法）[1]，取平均值。

2.2 體細(xì)胞計(jì)數(shù)[1-2]牛乳體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）用改進(jìn)的顯微鏡計(jì)數(shù)方法測(cè)定，4個(gè)大方格內(nèi)的全部體細(xì)胞按順序計(jì)數(shù)。公式：細(xì)胞總數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)=每1mL乳汁中的細(xì)胞數(shù)。

2.3 病原菌增菌及分離培養(yǎng) 將SCC初步篩選的各奶樣稀釋100倍，搖勻，分別用微量移液器吸取100μL于小牛血清肉湯中，37℃下增菌培養(yǎng)24～28h。取出后再接種于普通瓊脂平板、血平板和麥康凱平板上培養(yǎng)24～48h，觀察菌落形態(tài)和生長情況。然后分別涂片、革蘭氏染色、鏡檢，挑取各奶樣中占優(yōu)勢(shì)的病原菌落于肉湯（含100mg/L葡萄糖）內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)，供進(jìn)一步鑒定。

2.4 病原菌鑒定

2.4.1 溶血試驗(yàn) 分別將28份疑似乳房炎奶樣的純化培養(yǎng)液直接接種于兔鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察其溶血現(xiàn)象。

2.4.2 麥康凱鑒別培養(yǎng) 觀察麥康凱培養(yǎng)基上各奶樣中菌落的生長情況。對(duì)于無菌落生長的奶樣，重新接種培養(yǎng)24h后再觀察結(jié)果。

2.4.3 糖酵解試驗(yàn) 取疑似含有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌奶樣的肉湯液100μL分別接種到血瓊脂平板或斜板上培養(yǎng)18～24h。然后按照常規(guī)方法分別進(jìn)行甘露醇、果糖、山梨醇、木糖醇、尿素等生化試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

2.4.4 鏈球菌鑒別試驗(yàn)[3]除了已鑒定為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的奶樣外，其余奶樣的肉湯液都分別取100μL接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基、七葉苷培養(yǎng)基、甘露糖和山梨醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，記錄結(jié)果。

2.4.5 CAMP試驗(yàn)[4]在兔鮮血瓊脂平板上接種1條金黃色葡萄球菌的劃線，與此線垂直但不要接觸，二者距離3～5mm處接種疑似鏈球菌病奶樣的肉湯增菌液50μL，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 乳汁pH值檢測(cè)和體細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 采集的80份奶樣中，SCC超過10萬個(gè)/mL的樣品有30份，結(jié)果見表1。

表1 pH值檢測(cè)和體細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析顯示，奶樣的SCC與pH值的相關(guān)系數(shù)r不顯著（P＞0.05），表明乳腺組織的損傷程度不很嚴(yán)重，這與牦牛隱性乳房炎病變的體征相吻合。體細(xì)胞數(shù)是牦牛乳房健康狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是奶質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，當(dāng)牦牛患隱性乳房炎時(shí)，其乳汁中的SCC可達(dá)到10～15萬個(gè)/mL左右[1]。因此，本試驗(yàn)以SCC超過10萬個(gè)/mL作為初步判斷隱性乳房炎奶樣的標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 病原菌的分離培養(yǎng) 對(duì)普通瓊脂平板和血平板上生長的不同菌落分別進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，其結(jié)果如下：有呈革蘭氏陽性的鏈球狀和葡萄串珠狀的球菌；有呈革蘭氏陰性的鏈球狀球菌和大小不一的正直桿菌。由菌落形態(tài)和生長情況可初步判斷病原類屬有葡萄球菌、鏈球菌和桿狀菌等。

3.3 溶血試驗(yàn) 30份疑似乳房炎奶樣在鮮兔血瓊脂平板上培養(yǎng)的結(jié)果及溶血試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

根據(jù)培養(yǎng)后菌落形態(tài)、生長特性及溶血試驗(yàn)結(jié)果可大體上區(qū)分出21份奶樣為鏈球菌，3份奶樣為金黃色葡萄球菌，4份為大腸桿菌和其他桿菌，2份無明顯菌落生長。

溶血試驗(yàn)的血瓊脂培養(yǎng)基可見到三種溶血現(xiàn)象。一般而言，對(duì)紅細(xì)胞具有溶血能力的細(xì)菌有α、β、γ三種類型。α溶血為對(duì)稱綠色溶血型，此型不產(chǎn)生定型的溶血現(xiàn)象，在37℃培養(yǎng)24h后，于血液平板的深處形成綠灰色的菌落，其周圍有不透明的綠色輪暈。β溶血可在血液平板上的菌落周圍形成無色透明的溶血環(huán)，其直徑有時(shí)超過菌落的直徑。γ溶血又稱非溶血型，在血液平板的菌落周圍不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。鏈球菌屬于α溶血，以此可作為確定鏈球菌的依據(jù)。

表2 金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌培養(yǎng)特性

3.4 麥康凱鑒別 試驗(yàn)結(jié)果顯示，7份奶樣的菌株生長良好，而21份奶樣的麥康凱培養(yǎng)基不見或僅見少許菌落生長。由于鏈球菌類病原菌不在麥康凱培養(yǎng)基上生長，由此推測(cè)在此培養(yǎng)基上生長良好的7份奶樣疑似為除鏈球菌以外的其他病原菌。

3.5 糖酵解試驗(yàn) 將上述試驗(yàn)中疑似金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等病原菌的7份奶樣進(jìn)行糖酵解試驗(yàn)，其結(jié)果見表3。

鑒別結(jié)果表明，7份奶樣中有3份為金黃色葡萄球菌感染的奶樣，4份為大腸桿菌感染的奶樣。

3.6 鏈球菌分類鑒別 將上述3.2和3.3結(jié)果中21份疑似鏈球菌奶樣分別進(jìn)行相關(guān)鑒別試驗(yàn)，結(jié)果見表4。從表4可知，21例奶樣病原菌中，無乳鏈球菌有7例，乳房鏈球菌有9例，停乳鏈球菌有5例。

表3 糖酵解試驗(yàn)結(jié)果

表4 馬尿酸鈉、七葉苷、甘露糖、山梨醇試驗(yàn)

引起隱性乳房炎的鏈球菌主要為無乳、停乳和乳房鏈球菌三種類型。馬尿酸鈉試驗(yàn)可將無乳鏈球菌、乳房鏈球菌與停乳鏈球菌分開，因?yàn)闊o乳和乳房鏈球菌可在其培養(yǎng)基上出現(xiàn)極易鑒別的紫色環(huán)。甘露糖、山梨醇、七葉苷培養(yǎng)試驗(yàn)是乳房鏈球菌的鑒別試驗(yàn)，以培養(yǎng)基變棕黑色為主要特征。

3.7 CAMP試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，21份疑似鏈球菌病奶樣中，只有7份奶樣在有金黃色葡萄球菌產(chǎn)物存在或在兩種細(xì)菌交界處的β溶血力增加,出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)。表明這7份奶樣為無乳鏈球菌，該試驗(yàn)結(jié)果與馬尿酸鈉、七葉苷、甘露糖、山梨醇試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

4 結(jié)論

本文對(duì)紅原地區(qū)80份牦牛奶樣中的病原菌進(jìn)行了初步篩選，檢出28份疑似牦牛隱性乳房炎奶樣，檢出率為35%。28份疑似病原菌奶樣的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌有3份（10.71%），無乳鏈球菌有7份（25%），停乳鏈球菌有5份（17.86%），乳房鏈球菌有9份（32.14%），大腸桿菌有4份（14.29%）。表明牦牛奶樣中的病原菌以鏈球菌屬的分離率最高（75%），大腸桿菌和葡萄球菌的分離率都相對(duì)較低。由此可知，引起高原藏族地區(qū)牦牛隱性乳房炎的主要病原菌為鏈球菌屬，包括無乳鏈球菌、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌。筆者認(rèn)為，引起牦牛隱性乳房炎的環(huán)境鏈球菌的感染可能是放養(yǎng)牦牛產(chǎn)奶量低的主要原因之一?！?/p>

[1]GB/T 4789.28-2013.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[2] Svennersten-Sjaunja K.Evaluation of quality changes in udder quarter milk from cows with low-to-moderate somatic cell counts[J].Animal，2010，4（4）：617-626.

[3]遇培芝，劉軍，趙麗君，等.奶牛乳房炎鏈球菌的分離與鑒定[J].畜牧與飼料科學(xué)，2006（3）：34-36.

[4] Smith A J，Kitt A J，Ward P N，et al.Isolation and characterization of a mutant strain of Streptococcus uberis，which fails to utilize a plasmin derived βcasein peptide for the acquisition of methionine[J].J App Microbiol，2002，93（4）：631-639.

Isolation and Identification of Yak Subclinical Mastitis Pathogenic Bacteria from Milk Samples

Li Xiaoxu1，Liu Kan1，Zhang Xiaoqin2，et al.
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.Department of Chemistry，Chemical Engineering and Life Science，Aba Teachers College，Sichuan Wenchuan 623002，China）

Yak subclinical mastitis is considered one of the primary causes for decreasing the milk yield of yak in Tibetan plateau。It has great practical significance that explore and research the characteristic of pathogenic bacterium and epidemiology characteristic，could provide certain basis for the prevention of yak subclinical mastitis at Hongyuan Tibetan area.In this study，80 milk samples were collected from three different herd in Hongyuan county，30 milk samples were screened as suspected yak subclinical mastitis by milk somatic cell count and pH value.Afterwards，the suspected milk samples were cultivated for observation，biochemical identification，and other further testing.The results showed that，28 milk samples were subclinical mastitis in the 80 milk samples，its detection rate was 35%.Bacteriological tests indicated that among the 80 milk samples，staphylococcus aureus was account for 10.71%，streptococcus agalactiae was account for 25%，streptococcus uberis was account for 32.14%，streptococcus dysgalactiae was account for 17.86%，Escherichia coli was account for 14.29%。

Yak；Subclinical mastitis；Pathogenic bacteria；Milk sample；Isolation；Identification

S858.234.43

B

1001-8964（2017）03-0036-03

2016-12-25

李小旭（1992-），女，遼寧人，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)。

*通訊作者：郝葆青（1956-），男，四川人，碩士生導(dǎo)師，教授，博士后，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)。