王衛(wèi)強(qiáng)

（山西大醫(yī)院中醫(yī)科，山西 太原 030032）

穴位埋線對(duì)去卵巢大鼠骨密度及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

王衛(wèi)強(qiáng)

（山西大醫(yī)院中醫(yī)科，山西 太原 030032）

目的：觀察穴位埋線對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清IGF-1及TNF-α含量的影響。方法：40只雌性大鼠分為偽手術(shù)組10只，去卵巢組30只（空白模型組10只、穴位埋線組、雌二醇組各10只）行相應(yīng)治療，12周后取血清測(cè)E2、IGF-1、TNF-α的含量，單側(cè)股骨測(cè)骨密度。結(jié)果：空白模型組骨密度較偽手術(shù)組明顯降低，治療組顯著高于空白模型組（P＜0．05）。血清E2、IGF-1空白模型組含量低于偽手術(shù)組，治療組顯著高于空白模型組（P＜0．05）。血清TNF-α空白模型組含量顯著高于偽手術(shù)組，治療組顯著低于空白模型組（P＜0．05）。結(jié)論：穴位埋線對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠有一定的預(yù)防及延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)展的作用。

穴位埋線；大鼠；骨密度；E2；IGF-1；TNF-α

本研究采用去卵巢復(fù)制大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）模型，比較穴位埋線，雌激素對(duì)PMOP模型骨密度、血清E2、IGF-1、TNF-α含量的影響，為穴位埋線防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡未生育SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量240～280g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要試劑與儀器

E2放免試劑盒、IGF-1放免試劑盒，TNF-α放免試劑盒（天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司）。皮內(nèi)針（麥粒型，江蘇華佗醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）。苯甲酸雌二醇（上海通用藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)050101）2mg/mL。雙能X線骨密度測(cè)量儀（法國CHALLENGER公司）。多頭放射免疫檢測(cè)儀（GC-2010，中國科大中佳公司）。

3 動(dòng)物飼養(yǎng)

各組動(dòng)物在相同環(huán)境中分組分籠喂養(yǎng)，每籠5只，環(huán)境溫度（20±3）℃，每天12h光照，12h黑暗，相對(duì)濕度40%左右，自由攝食和飲水。飼料成分為面粉20%、玉米粉20%、麥麩粉15%、魚粉5%、豆餅20%、骨粉2%、食鹽1%、植物油2%、奶粉15%，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

4 動(dòng)物分組

40只雌性大鼠隨機(jī)分為偽手術(shù)組10只與去卵巢模型30只。將30只去卵巢大鼠隨機(jī)分為空白模型組10只和治療組20只，分別為穴位埋線組和雌激素組，各組10只。

5 造 模

去卵巢大鼠模型用10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，在劍突下2cm處腹正中線上行1.5cm縱向切口，完整摘除雙側(cè)卵巢，縫合腹腔。偽手術(shù)組（Sham）同樣麻醉后在無菌條件下打開腹腔，不摘除卵巢，僅摘除卵巢周圍的脂肪組織，大小與卵巢相同，分兩層縫合。手術(shù)后給予常規(guī)青霉素肌注3天。

6 實(shí)驗(yàn)方法

穴位埋線組：選大鼠脾俞、腎俞，用7號(hào)埋線針，長約5～8mm，3個(gè)0的羊腸線進(jìn)行埋線，2周1次。

雌激素組：以苯甲酸雌二醇后肢肌內(nèi)注射，按人鼠劑量換算，每只鼠每次肌內(nèi)注射0.1mg/kg，每周1次。在造膜1周后進(jìn)行治療，為期12周。

空白模型組及偽手術(shù)組：雌激素組治療時(shí)，同樣空白模型組及偽手術(shù)組兩組大鼠相應(yīng)抓取按壓刺激，以保證條件的均衡性。

7 取材與測(cè)量

大鼠治療12周后，股動(dòng)脈取血，收集血清，應(yīng)用放免法檢測(cè)血清E2、IGF-1 及TNF-α（由貴陽醫(yī)學(xué)院附院中心實(shí)驗(yàn)室十三協(xié)助完成）。無菌條件下完整取出右側(cè)后肢股骨，剔凈軟組織。用雙能X線骨密度儀測(cè)量，以“Small Animal Scout Scan”分析，掃描寬度為15cm，掃描速度60mm/s，對(duì)股骨整體、股骨近端、股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行骨密度及骨礦含量檢測(cè)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

9 結(jié) 果

各組股骨骨礦含量與骨密度見表1。

表1 各組股骨骨礦含量與骨密度比較 （±s）

表1 各組股骨骨礦含量與骨密度比較 （±s）

注：與空白模型組比較，△P＜0.05。

組別 n 股骨整體BMC（g）股骨整體BMD（mg/cm）股骨近端BMD（mg/cm）

各組血清E2、IGF-1、TNF-α含量見表2。

表2 各組血清E2、IGF-1、TNF-α比較 （±s）

表2 各組血清E2、IGF-1、TNF-α比較 （±s）

注：與空白模型組比較，*P＜0.05；與偽手術(shù)組比較，#P＜0.05；與雌二醇組比較，△P＜0.05。

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10 討 論

雌激素是維持骨吸收和骨形成平衡的重要因素，雌激素水平降低導(dǎo)致骨形成抑制、骨吸收亢進(jìn)已得到多數(shù)學(xué)者的公認(rèn)。通過穴位埋線的治療，去卵巢大鼠的骨密度及骨礦含量較模型組顯著提升，且與雌激素及偽手術(shù)組無差異。穴位埋線組血清E2水平低于偽手術(shù)組且有顯著性差異，而穴位埋線組的骨密度與骨礦含量與偽手術(shù)組無明顯差異，可見穴位埋線對(duì)去卵巢大鼠作用不單純是通過提高雌激素水平來介導(dǎo)的，還可能通過其它激素及包括IGF-1、TNF-α在內(nèi)的一些相關(guān)細(xì)胞因子的相互作用來達(dá)到減緩骨質(zhì)疏松進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)IGF-I是包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的促有絲分裂劑，IGF－1促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和募集，抑制細(xì)胞凋亡，刺激骨膠原的轉(zhuǎn)錄和DNA合成，抑制膠原的降解，增加骨基質(zhì)沉積。IGF-1也可通過不依賴促有絲分裂的途徑促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化，它以自分泌和旁分泌的形式調(diào)節(jié)骨骼細(xì)胞的功能，影響骨代謝［1］。Ostrowska等［2］采用去卵巢大鼠做骨質(zhì)疏松模型，動(dòng)態(tài)觀察血清IGF-1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清IGF-I濃度呈減低趨勢(shì)，術(shù)后2-28周顯著低于假手術(shù)對(duì)照組，在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。隨著婦女更年期雌激素水平的下降，誘導(dǎo)骨吸收的細(xì)胞因子產(chǎn)生過多，使骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)。TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)有力的骨吸收誘導(dǎo)劑，TNF-α引起骨吸收主要是通過刺激前祖細(xì)胞產(chǎn)生新的破骨細(xì)胞以增加破骨細(xì)胞數(shù)量，間接激活成熟的破骨細(xì)胞增強(qiáng)其吸收功能，并抑制破骨細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出對(duì)骨的快速分解效果［3］。TNF-α同時(shí)還可抑制成骨細(xì)胞的功能，降低成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，以減少骨基質(zhì)鈣化。研究發(fā)現(xiàn)［4］，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人外周血中單個(gè)核細(xì)胞釋放的TNF-α明顯高于非絕經(jīng)婦女或雌激素替代治療絕經(jīng)婦女，且與腰椎骨密度負(fù)相關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出了類似結(jié)果。

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇，《素問·痿論》曰：“腎氣熱，則腰背不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”華佗在《中藏經(jīng)·五痹》中曰：“骨痹者，乃嗜欲不節(jié)，傷于腎也。腎氣內(nèi)消則不能關(guān)禁，不能關(guān)禁則中上俱亂，中上俱亂則三焦之氣痞而不通。三焦痞，則飲食不糟粕，飲食不糟粕，則精氣日衰，精氣日衰，則邪氣妄入。邪氣妄入……下流腰膝，則為不遂，旁攻四肢，則為不仁，寒在中則脈遲……”認(rèn)為骨質(zhì)疏松發(fā)病的根本原因在于腎虛，由腎虛導(dǎo)致三焦之氣機(jī)不暢，脾失健運(yùn)，水谷精微不化，外邪乘虛而入所致。可見骨質(zhì)疏松與脾腎虛衰的關(guān)系最為密切。因此，防治骨質(zhì)疏松癥必須以糾正脾腎虛虧為主。本實(shí)驗(yàn)選取脾俞、腎俞以健脾補(bǔ)腎、強(qiáng)筋壯骨，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。通過背俞穴肌肉、神經(jīng)、血管、淋巴等組織的刺激作用于全身，使大鼠下丘腦-垂體-多個(gè)靶腺軸及植物神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能的紊亂恢復(fù)。顯示穴位埋線可使模型大鼠骨密度與骨礦含量顯著增加且與雌激素組無差異?？赡軝C(jī)制是通過臟腑經(jīng)絡(luò)的調(diào)理，提高模型動(dòng)物雌激素水平，提高機(jī)體的代謝，增加腸道對(duì)Ca的吸收利用，提高IGF-I的表達(dá)，降低TNF-α表達(dá)及調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子和激素，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，使成骨活動(dòng)增強(qiáng)，抑制破骨細(xì)胞增殖分化，使破骨活動(dòng)減弱，從而預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松。

雌激素替代療法（Estrogen Replacement therapy，ERT）是預(yù)防和治療PMOP以及預(yù)防骨折的首選方法，但大量研究表明長期使用雌激素類藥物有導(dǎo)致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的潛在危險(xiǎn)［5］。實(shí)驗(yàn)可知，穴位埋線預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松能起到ERT的相同作用。且穴位埋線無副作用，故穴位埋線防治骨質(zhì)疏松癥具有較大的潛力與優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步的深入研究。

［1］ CELIKER R，ARSLAN S．comparison of serum insulin-like growth factor-1 and growth hormone levels in osteoporotic and non-osteoporotic post-menopausal women［J］．Rheumatology International，2000，19（6）：205-208．

［2］ OSTROWSKA Z，KOS-KUDLA B，MAREK B，et al．Dynamic pattern of IGF-1 and chosen biochemical markers of bone metabolism in a rat model of postmenopausal osteoporosis［J］．Endocrine Regulations，2002，36（1）：9-17．

［3］ KOBAYASHI K，TAKAHASHI N，JIMI E，et al．Tumor necrosis factor a1pha stimu1ates osteoblast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction［J］．J Exp Med，2000；191（2）：275-286．

［4］ NANES MS．Tumor necrosis factora：molecular and cellular mechanisms in skeletal pathology［J］．Gene，2003，321（56）：1-15．

［5］ 田李軍．中醫(yī)藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究概況［J］．四川中醫(yī)，2002，20（2）：22．

Objective：To observe the effect of catgut implantation at acupoint on content of serum IGF-1 and TNF-α in ovariectomized osteoporosis(OVX-OP) rats. Method：Forty rats were divided into four groups，ten rats in each group.The first group were sham-operated（Sham-G） while the remaining groups，established by excising both sides ovary，were catgut implantation at acupoint group（EAG），estradiol group（EG） and model group（MG）.There wasn’t any therapy in sham-operated group and model group.After 12 week corresponding therapy，all groups were sacrificed to procure blood serum for testing the contents of E2，IGF-1，TNF-α and right retral thighbone for testing bone mineral density（BMD）.Result：The BMD of thighbone， IGF-1 of serum in EAG and EG was compared with Sham-G，there was no significant difference，but which was higher than MG（P＜0.05），at same time which of MG was lower than Sham-G. TNF-α of serum in MG was higher than Sham-G，EAG and EG（P＜0.05），but no significant difference was found among Sham-G，EAG and EG. Conclusion：Catgut implantation at acupoint could promote BMD in ovariectomized osteoporosis rats，so they can probably be usesed to prevent and treat PMOP.

Catgut implantation at acupoint；rat； bone mineral density；E2 ；IGF-1；TNF-α

R245.919.144

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1004-2814（2017）02-0112-02

2016-09-26