兒童幽門螺桿菌毒力基因與抗生素耐藥相關(guān)性研究

張雙紅1謝 勇1李弼民1劉東升1萬盛華2羅麗娟2李 紅3易麗君3周 菁3朱 萱11.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科（江西南昌 330006）； 2.江西省兒童醫(yī)院消化科（江西南昌 330006）；3.江西省兒童醫(yī)院中心實驗室（江西南昌 330006）

目的探討兒童幽門螺桿菌（H. pylori）臨床分離株毒力基因與抗生素耐藥之間的關(guān)系。方法從具有上消化道癥狀的90例患兒胃竇黏膜中分離培養(yǎng)H. pylori陽性菌株，采用E-test法和K-B法檢測H. pylori對抗生素耐藥性，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測H. pylori cagA、vacA及iceA基因。結(jié)果在胃竇黏膜分離培養(yǎng)的90株H. pylori菌株中，8株（8.9%）對克拉霉素耐藥，31株（34.4%）對甲硝唑耐藥，12株（13.3%）對克拉霉素和甲硝唑二重耐藥，39株（43.3%）對抗生素均不耐藥，未發(fā)現(xiàn)對阿莫西林和呋喃唑酮耐藥的H. pylori菌株；cagA基因陽性檢出率為93.3%（84/90），vacAs1a、vacAs1c、vacAm1和vacAm2基因陽性檢出率分別為77.8%（70/90）、22.2%（20/90）、32.2%（29/90）和 67.8%（61/90），vacAs1a/m1、vacAs1a/m2、vacAs1c/m1和vacAs1c/m2基因陽性檢出率分別為30.0%（27/90）、51.1%（46/90）、3.3%（3/90）和16.7%（15/90），iceA1和iceA2基因陽性檢出率分別為87.7%（79/90）和7.8%（7/90）。H. pylori毒力基因型在克拉霉素耐藥組、甲硝唑耐藥組、克拉霉素+甲硝唑二重耐藥組和對抗生素敏感組四組間的陽性檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。結(jié)論兒童H. pylori臨床分離菌株毒力基因型與抗生素耐藥無相關(guān)性。

幽門螺桿菌； 毒力基因； 耐藥性； 兒童

兒童幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H. pylori）感染首先推薦的根除治療方案是采用含質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）加2種抗生素的三聯(lián)療法。但是H. pylori根除率呈逐漸降低趨勢，出現(xiàn)了抗H. pylori根除治療失敗的情況[1,2]。在臨床中，三聯(lián)療法根除治療失敗是由多種因素所致，其中，H. pylori菌株毒力基因和H. pylori對抗生素耐藥是導(dǎo)致根除治療失敗的兩個重要原因[3,4]。本研究通過檢測具有上消化道癥狀兒童所感染的H. pylori臨床分離菌株cagA、vacA及iceA基因和H. pylori對抗生素耐藥性，探討H. pylori毒力基因與抗生素耐藥的關(guān)系。

1 臨床資料

選取2014年7月至2015年8月因腹痛、嘔吐、噯氣、嘔血及黑便等上消化道癥狀在江西省兒童醫(yī)院就診并接受胃鏡檢查的患兒，共90例。其中男67例、女23例，年齡1歲9個月～14歲，中位年齡10歲。診斷為慢性胃炎28例，十二指腸球炎13例和消化性潰瘍49例。全部病例胃鏡檢查前未接受過H. pylori根除治療，排除胃鏡檢查前4周內(nèi)服用PPI、H2受體拮抗劑、非甾體類消炎藥、鉍劑或抗生素者。本研究通過了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.JXSETYY-2016003），并獲家屬知情同意。

將上述患兒胃竇黏膜標(biāo)本用勻漿器研磨后，均勻涂布于Karmali培養(yǎng)基（英國Oxoid公司，批號：1468121）上，在微需氧條件（溫度37℃，5%O2，10%CO2，85%N2）下培養(yǎng)3～7 d。找出光滑、邊緣整齊、灰白、圓形、半透明的典型菌落進(jìn)行傳代和增菌培養(yǎng)獲得H. pylori菌株，經(jīng)革蘭染色、快速尿素酶試驗、顯微鏡下形態(tài)觀察以及生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定后，進(jìn)一步采用H. pylori基因組DNA抽提試劑盒，分別提取各菌株的DNA，采用H. pylori ureA基因PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，將H. pylori陽性菌株于保存液中_80℃冰箱保存。H. pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11639獲贈于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化研究所。

采用E-test法檢測阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑3種抗生素對H. pylori的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)；利用K-B法檢測呋喃唑酮對H. pylori的敏感性。取200 μL菌懸液使用自動旋轉(zhuǎn)涂布儀均勻涂布于直徑90 mm Mueller-Hinton瓊脂（英國Oxoid公司，批號：1344946）培養(yǎng)皿上，用無菌鑷子將阿莫西林藥敏試紙條（法國梅里埃生物公司，批號：1002516160）、克拉霉素藥敏試紙條（法國梅里埃生物公司，批號：1000902370）、甲硝唑E-test藥敏試紙條（法國梅里埃生物公司，批號：1003007690）和呋喃唑酮藥敏試紙片（英國Oxoid公司，批號1426118）分別緊貼于瓊脂培養(yǎng)基的表面，在微需氧條件下培養(yǎng)2～3 d后觀察結(jié)果。橢圓形抑菌環(huán)與E-test試紙條的交界點藥物濃度值即為MIC值；用直尺量取抑菌圈直徑。H. pylori耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)：阿莫西林MIC ≥ 1 μg/mL為耐藥，克拉霉素MIC ≥ 1 μg/ mL為耐藥，甲硝唑MIC ≥ 8 μg/mL為耐藥；K-B法抑菌圈直徑 ≤ 7 mm為呋喃唑酮耐藥。

在患兒胃竇黏膜分離培養(yǎng)的90株H. pylori菌株中，8株（8.9%）對克拉霉素耐藥，31株（34.4%）對甲硝唑耐藥，12株（13.3%）對克拉霉素和甲硝唑二重耐藥，39株對抗生素均不耐藥；未發(fā)現(xiàn)對阿莫西林和呋喃唑酮耐藥的H. pylori菌株。

嚴(yán)格按照說明書使用基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：151022770）對所有H. pylori菌株進(jìn)行基因組DNA 提取，避免樣本之間的交叉污染，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司，型號：NanoDrop 2000）檢測所提取H. pylori菌株基因組DNA的濃度。H. pylori菌株基因組DNA保存于_20℃冰箱待測。使用文獻(xiàn)[5-8]中提供的檢測H. pylori ureA、cagA、vacA和iceA的引物序列和擴(kuò)增片段長度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在90株菌株中可擴(kuò)增出ureA、cagA、vacAs1、vacAs1a、vacAs1c、vacAm1、vacAm2、iceA1和ieeA2基因亞型陽性產(chǎn)物，但是在本組所有菌株中未擴(kuò)增出vacAs1b和vacAs2基因的陽性產(chǎn)物。見圖1。

圖1 H. pylori ureA、cagA、vacA和iceA基因PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

在90株H. pylori菌株中，ureA基因陽性檢出率為100%（90/90），cagA基因陽性檢出率為93.3%（84/90）；vacA基因陽性檢出率為100%（90/90），其中vacAs1a、vacAs1c、vacAm1和vacAm2基因陽性檢出率分別為77.8%（70/90）、22.2%（20/90）、32.2%（29/90） 和67.8%（61/90）；在vacA基因的嵌合體中，vacAs1a/m1，vacAs1a/m2，vacAs1c/m1和vacAs1c/m2基因陽性檢出率分別為30.0%（27/90），51.1%（46/90），3.3%（3/90）和16.7%（15/90）；iceA1和iceA2基因陽性檢出率分別為87.8%（79/90）和7.8%（7/90）。見表1。

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H. pylori毒力基因型在克拉霉素耐藥組、甲硝唑耐藥組、克拉霉素+甲硝唑二重耐藥組和對抗生素敏感組四組間的陽性檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

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2 討論

H. pylori是一種革蘭陰性螺桿菌，寄生于人體胃黏膜內(nèi)，在胃腸道疾病的發(fā)生中起重要作用，是導(dǎo)致兒童胃十二指腸疾病發(fā)生的重要病原菌[9]。在兒童時期，H. pylori感染后的臨床結(jié)局主要受菌株類型、宿主遺傳易感性和環(huán)境因素等影響，其中H. pylori毒力基因多態(tài)性和H. pylori耐藥菌株的出現(xiàn)是兩個重要原因。有研究表明，H. pylori毒力基因是影響臨床根除治療效果的重要因素[10]。目前，臨床上可用于兒童感染H. pylori根除治療的抗生素種類不多，主要有阿莫西林、克拉霉素及甲硝唑，而呋喃唑酮和氟喹諾酮類藥物在兒童時期慎用。隨著抗生素在兒童抗H. pylori根除治療中的廣泛應(yīng)用，H. pylori對抗生素的耐藥率，尤其是對甲硝唑和克拉霉素的耐藥率正在逐漸上升，對阿莫西林的耐藥率很低，不過也出現(xiàn)了增高的趨勢，甚至在臨床中出現(xiàn)了多重耐藥菌株，使得兒童感染H. pylori的治療根除率下降，嚴(yán)重影響了臨床治療效果[11]。本研究在患兒胃竇黏膜分離培養(yǎng)的90株H. pylori菌株中，8株（8.9%）對克拉霉素耐藥，31株（34.4%）對甲硝唑耐藥，12株（13.3%）對克拉霉素和甲硝唑二重耐藥，39株對抗生素不耐藥；未發(fā)現(xiàn)對阿莫西林和呋喃唑酮耐藥的菌株，這與其他研究結(jié)果類似。有文獻(xiàn)報道，H. pylori對甲硝唑耐藥率達(dá)到13.9%～53.0%，對克拉霉素達(dá)到12.0%～34.7%，阿莫西林為0%～10.4%[12-15]。

本研究對具有上消化道癥狀兒童胃竇黏膜分離培養(yǎng)的H. pylori菌株毒力基因與抗生素耐藥的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在90株H. pylori菌株中，cagA基因陽性檢出率為93.3%；vacA基因陽性檢出率為100%，其中vacAs1a、vacAs1c、vacAm1和vacAm2基因陽性檢出率分別為77.8%、22.2%、32.2%和 67.8%；在vacA基因的嵌合體中，vacAs1a/m1，vacAs1a/m2，vacAs1c/m1和vacAs1c/m2基因陽性檢出率分別為30.0%、51.1%、3.3%和16.7%；但在本組所有菌株中未檢測出vacAs1b和vacAs2基因亞型；iceA1和iceA2基因陽性檢出率分別為87.8%和7.8%。H. pylori毒力基因型在克拉霉素耐藥組、甲硝唑耐藥組、克拉霉素+甲硝唑二重耐藥組和對抗生素敏感組四組間的陽性檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明兒童H. pylori臨床分離菌株毒力基因型與抗生素耐藥無相關(guān)性。目前認(rèn)為，H. pylori菌株毒力基因?qū). pylori根除治療有重要影響，但是其與H. pylori對抗生素耐藥是否有關(guān)，國內(nèi)外研究結(jié)果尚不一致。早期意大利的一項研究顯示，H. pylori菌株毒力基因與抗生素耐藥之間無相關(guān)性[16]。另一項研究結(jié)果也表明，H. pylori vacA基因分型與抗生素耐藥無關(guān)[17]。但是，巴西一項研究對從217例患兒胃黏膜中培養(yǎng)的45例H. pylori菌株進(jìn)行了毒力基因型與抗生素耐藥關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)H. pylori毒力基因與克拉霉素耐藥有關(guān)[18]。有研究表明，H. pylori cagA基因與抗生素耐藥有關(guān)[19]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori vacAs1a/m2基因與抗生素耐藥率升高有關(guān)[20]。各項研究結(jié)果不一致的可能原因是：H. pylori毒力基因型分布特征存在明顯的地區(qū)差異，不同國家和地區(qū)菌株的優(yōu)勢基因分布不同；H. pylori菌株本身對抗生素的耐藥率也具有明顯的地區(qū)差異；H. pylori菌株具有廣泛的異質(zhì)性，即不同菌株具有完全不同的基因型，不同患者感染基因型不同的菌株；H. pylori存在混合感染現(xiàn)象，即同一患者可同時感染1株以上的菌株，甚至同一部位也可同時存在不同的菌株，混合感染可以是菌株表型的不同，也可以是基因型的不同；此外，還可能與被檢測的人群、胃黏膜活檢采集的部位和數(shù)目不同有關(guān)[21-25]。

總之，本研究顯示，兒童H. pylori臨床分離菌株毒力基因型與抗生素耐藥無相關(guān)性。由于本研究中病例來源不能完全做到完全隨機(jī)，這是本研究的不足之處，上述結(jié)論尚需嚴(yán)格設(shè)計的大樣本隨機(jī)對照臨床試驗加以驗證。

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The correlation of virulence genes and antibiotic resistance in Helicobacter pylori isolates in children

ZHANG Shuanghong1, XIE Yong1, LI Bimin1, LIU Dongsheng1, WAN Shenghua2, LUO Lijuan2, LI Hong3, YI Lijun3, ZHOU Jing3, ZHU Xuan1(1. Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University; 2. Department of Gastroenterology, Children's Hospital of Jiangxi; 3. Central Laboratory, Children's Hospital of Jiangxi, Nanchang 330006, Jiangxi, China)

ObjectiveTo explore the relationship between virulence genes and antibiotic resistance inHelicobacter pylori(H. pylori) isolates in children.MethodsThe stains ofH. pyloriwere isolated from antral mucosa in 90 pediatric patients with upper gastrointestinal symptoms. E-test and K-B test were used to detect the antibiotic resistance ofH. pyloriisolates. PCR was performed to detect thecagA,vacAandiceAgenes ofH. pylori.ResultsAmong these 90 strains ofH. pyloriisolated from antral mucosa, there were 8 strains (8.9%) resistant to clarithromycin, 31 strains (34.4%) resistant to metronidazole, 12 trains (13.3%) resistant to clarithromycin and metronidazole, and 39 strains (43.3%) not resistant to antibiotics. There were no strains resistant to amoxicillin or furazolidone. The positive detection rate ofcagAgene,vacAs1a, vacAs1c, vacAm1, and vacAm2genes were 93.3% (84/90), 77.8% (70/90), 22.2% (20/90), 32.2% (29/90), and 67.8% (61/90), respectively. The positive detection rates ofvacAs1a/m1, vacAs1a/m2, vacAs1c/m1, and vacAs1c/m2genes were 30.0% (27/90), 51.1% (46/90), 3.3% (3/90), and 16.7% (15/90), respectively. The positive detection rates oficeA1andiceA2genes were 87.7% (79/90) and 7.8% (7/90), respectively. There was no difference in positive detection rate ofH. pylorivirulence genes among clarithromycin resistance group, metronidazole resistant group, clarithromycin and metronidazole double resistance group and antibiotics sensitive group (P＞ 0.05).ConclusionThere was no relationship between virulence gene and antibiotic resistance inH. pyloriclinical isolates in children.

Helicobacter pylori； virulence genotypes； resistance； child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.01.016

2016-07-17）

（本文編輯： 鄒 強(qiáng)）

江西省科技廳科技支撐計劃立項（No. 20151BBG70092）

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