陳 君，陳 麗，韋建華（.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西柳州 545005；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧53000）

廣西倒地鈴體外抗氧化活性的譜效關(guān)系研究Δ

陳 君1＊，陳 麗1，韋建華2（1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西柳州 545005；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530001）

目的：建立11批廣西倒地鈴的指紋圖譜并考察其體外抗氧化活性的譜效關(guān)系，為揭示其抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：采用高效液相色譜法建立11批廣西倒地鈴的指紋圖譜，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法測定不同產(chǎn)地倒地鈴的體外抗氧化活性，并運(yùn)用雙變量相關(guān)性分析法考察倒地鈴體外抗氧化的譜效關(guān)系。結(jié)果：11批廣西倒地鈴圖譜的相似度均大于0.9，16個共有峰中2（原兒茶酸）、3、4、12號峰含量變化與DPPH自由基清除活性大小密切相關(guān)。結(jié)論：廣西不同產(chǎn)地倒地鈴的化學(xué)成分基本一致，但產(chǎn)地不同時質(zhì)量有一定差異；原兒茶酸（2號峰）及3、4、12號峰代表的未知化合物可能是其抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

廣西；倒地鈴；體外抗氧化活性；指紋圖譜

倒地鈴（Cardiospermum halicacabum L.）為無患子科倒地鈴屬植物，又名三角泡、假苦瓜、風(fēng)船葛等，廣泛分布于廣西、廣東、四川、貴州等地區(qū)，具有清熱解毒、涼血、祛瘀、利尿等功效，民間多用于治療百日咳、糖尿病、咽喉炎、皮膚濕疹、跌打損傷等[1-3]。中藥化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也是其質(zhì)量評價的重點(diǎn)與難點(diǎn)。中藥指紋圖譜可以比較全面地反映中藥所含的化學(xué)成分，但所展現(xiàn)的化學(xué)成分與藥效的相關(guān)程度并不清楚。若將指紋圖譜與中藥藥效評價相結(jié)合，找出與藥效活性相關(guān)的藥效成分群，確定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)，可使構(gòu)建的指紋圖譜更有針對性地用于中藥質(zhì)量控制[4]。筆者前期研究表明，倒地鈴全草中主要含有黃酮、三萜類、甾醇及有機(jī)酸等多種成分，并有顯著的抗氧化活性[5-6]。在本研究中，筆者擬建立11批廣西倒地鈴藥材的指紋圖譜，并通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗考察其體外抗氧化作用，運(yùn)用雙變量相關(guān)性分析研究倒地鈴共有色譜峰含量變化與DPPH自由基清除活性的關(guān)系，建立倒地鈴藥材體外抗氧化活性的譜效關(guān)系，為倒地鈴的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元低壓梯度泵、在線真空泵、紫外檢測器、Chemstation色譜工作站（美國安捷倫公司）；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AL104電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.2 對照品與試劑

原兒茶酸對照品（北京盈澤納新化工技術(shù)研究院，批號：MUST-13103006，純度：98.0%）；金圣草黃素、芹菜素對照品（自制，純度：均＞98%）；DPPH（美國Sigma公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為市售分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

11批倒地鈴藥材為筆者親自采收或購自來賓、百色靖西、玉林等藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室廖月葵高級實驗師鑒定均為無患子科植物倒地鈴Cardiospermum halicacabum L.的干燥全草。倒地鈴藥材產(chǎn)地及采收時間見表1。

表1 倒地鈴藥材產(chǎn)地及采收時間Tab 1 The origin and harvest time of C.halicacabum

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil?ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（A），梯度洗脫（0～10 min，95%A→80%A；10～30 min，67%A→30%A；30～45 min，30%A→5%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取原兒茶酸、金圣草黃素、芹菜素對照品適量，加甲醇溶解后定容至10 mL量瓶中，搖勻。再精密吸取各溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，再加甲醇溶解并定容，即得原兒茶酸、金圣草黃素、芹菜素質(zhì)量濃度分別為13.4、17.2、15.2 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取不同產(chǎn)地倒地鈴（S1～S11）粉末各約1 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min，放冷后再稱定質(zhì)量，然后用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 取空白溶劑（70%乙醇）和倒地鈴藥材（S2）的供試品溶液各1份，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果，空白溶劑不干擾測定，各色譜峰分離度均大于1.5，表明該方法專屬性較好。

2.3.2 精密度 取倒地鈴藥材（S2）的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。以芹菜素的保留時間與峰面積為參照，換算出各共有峰相對保留時間的RSD值均小于1%（n＝5），相對峰面積的RSD值均小于3%，表明方法采用的HPLC儀器及整體系統(tǒng)精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性 取同一批倒地鈴（S2）藥粉5份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以芹菜素的保留時間與峰面積為參照，換算出各共有峰相對保留時間的RSD值均小于1%（n＝5），相對峰面積的RSD值均小于3%（n＝5），表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.4 穩(wěn)定性 取倒地鈴藥材（S2）的供試品溶液，于室溫下分別放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以芹菜素的保留時間與峰面積為參照，換算出各共有峰相對保留時間的RSD值均小于1%（n＝5），相對峰面積的RSD值均小于3%（n＝5），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的研究[7-9]

2.4.1 HPLC圖譜的建立及特征峰的指認(rèn) 取不同產(chǎn)地的倒地鈴（S1～S11）粉末，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。比較11批倒地鈴樣品的色譜圖，確立了倒地鈴藥材共有峰16個。其中芹菜素的信號強(qiáng)度適中，分離度和峰形較好，在各個不同來源的倒地鈴藥材樣品中均含有此峰且較穩(wěn)定，因此以其為參照峰。將混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)行峰位定位，確定供試品圖中2號峰是原兒茶酸、14號峰是芹菜素、15號峰是金圣草黃素。11批倒地鈴藥材指紋圖譜及對照圖譜見圖1，S2樣品及混合對照品的HPLC圖譜見圖2。

圖1 11批倒地鈴藥材指紋圖譜及對照圖譜Fig 1 Fingerprints and reference fingerprint of 11 batches of C.halicacabum

圖2 倒地鈴S2樣品及混合對照品的HPLC圖譜Fig 2 HPLC chromatograms of S2 sample of C.halicacabum and mixed reference substance

2.4.2 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（中國藥典委員會2004A）對11批倒地鈴藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以樣品S2的圖譜為參照，采用中位數(shù)法，按Mark峰進(jìn)行自動匹配生成倒地鈴對照指紋圖譜。將該對照指紋圖譜的相似度定為1，計算出11批倒地鈴指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明11批藥材在化學(xué)成分的組成上基本一樣。

2.4.3 聚類分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，以11批不同產(chǎn)地倒地鈴的HPLC指紋圖譜中16個共有峰的相對峰面積，采用歐氏距離進(jìn)行聚類分析，將11批不同產(chǎn)地的倒地鈴大致劃分為兩大類，6號樣品為第Ⅱ類，其他樣品均為第Ⅰ類，結(jié)果見圖3。

圖3 11批倒地鈴指紋圖譜的聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis dendrogram of the fingerprints of 11 batches of C.halicacabum

2.5 體外抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH溶液的制備 精密稱定DPPH適量，加95%乙醇定容至50 mL量瓶中，即得DPPH質(zhì)量濃度為0.057 mg/mL的溶液，低溫避光保存。

2.5.2 DPPH自由基清除率的測定 按“2.2.2”項下方法制備倒地鈴（S1～S11）的供試品溶液，分別精密吸取0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0 mL溶液，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，搖勻，制成6個系列質(zhì)量濃度的樣品溶液。精密吸取各樣品溶液2 mL，分別加入2 mL的DPPH溶液，搖勻，避光放置30 min，于517 nm波長處測定溶液的吸光度（A），計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）＝[A0－（A1－As）]/A0×100%（其中，A0為2 mL DPPH溶液+2 mL 70%乙醇的A；A1為2 mL DPPH溶液+ 2 mL樣品溶液的A；As為2 mL 70%乙醇+2 mL樣品溶液的A[10]）。以樣品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，采用Probit模型計算清除DPPH自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）。結(jié)果，樣品S1～S11對DPPH自由基均有明顯的清除活性，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大（詳見圖4），IC50值分別為1.60、0.86、0.95、0.99、2.30、2.61、1.34、1.11、0.45、1.41、4.88 mg/mL。結(jié)果提示，11批倒地鈴的抗氧化作用明顯，其中樣品S11的作用相對較弱，S9作用最強(qiáng)。

2.6 指紋圖譜與抗氧化活性的譜效關(guān)系分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對16個共有峰峰面積與倒地鈴的IC50進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。結(jié)果，16個特征色譜峰中2號峰（原兒茶酸）含量變化與DPPH自由基清除活性呈非常顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；3、4、12號峰含量變化與DPPH自由基清除活性呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。特征指紋峰與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)測定結(jié)果見表2。

圖4 11批倒地鈴抗氧化活性測定結(jié)果Fig 4 Determination results of antioxidant activity of 11 batches of C.halicacabum

表2 特征指紋峰與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)測定結(jié)果Tab 2 Determination of correlation coefficient between characteristic fingerprint peak and antioxidant activity

3 討論

本研究采用HPLC法建立了廣西11批倒地鈴的指紋圖譜，使倒地鈴的共有成分在色譜圖中得以體現(xiàn)；結(jié)合相似度評價和聚類分析可知，11批藥材的相似度大于0.9，16個共有峰的相對保留時間符合程度較好，化學(xué)成分的組成基本一致；但相對峰面積差別較大，說明不同產(chǎn)地倒地鈴藥材質(zhì)量存在一定的差異。同時，本研究以DPPH自由基清除法比較了不同產(chǎn)地倒地鈴樣品溶液的抗氧化作用。結(jié)果表明倒地鈴樣品溶液抗氧化作用明顯；結(jié)合倒地鈴的指紋圖譜進(jìn)行譜效關(guān)系研究，得出2、3、4、12號峰與抗氧化作用相關(guān)性顯著。然而本研究只鑒定出2號峰為原兒茶酸，3、4、12號峰為何種化合物還需進(jìn)一步考察。

[1] 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編：下冊[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：513.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊[M].上海：上海人民出版社，1977：3862.

[3] 中華本草編委會.中華本草：第5卷[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：3969.

[4] 鄧書鴻，聶磊.中藥譜效關(guān)系的分析方法及數(shù)據(jù)處理技術(shù)研究進(jìn)展[J].中藥材，2010，33（11）：1819-1823.

[5] 韋建華，陳君，蔡少芳，等.倒地鈴化學(xué)成分研究：1[J].中草藥，2011，42（8）：1509-1511.

[6] 陳君，韋建華，蔡少芳，等.倒地鈴有效部位化學(xué)成分研究[J].中藥材，2013，36（2）：228-230.

[7] 陳帥，王慧竹，薛健飛，等.梔子金花丸HPLC指紋圖譜及其與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析[J].中國藥房，2016，27（22）：3077-3080.

[8] 張彥飛，李智萌，趙利利，等.兩頭尖的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2016，27（3）：399-401.

[9] 宋瀟，謝昭明，黃丹，等.茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2015，26（15）：2019-2111.

[10] 李生茂，劉琳，譚睿，等.市售沙棘HPLC指紋圖譜一致性及抗氧化活性譜效關(guān)系[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（11）：43-48.

Study on the Spectrum-effect Relationship of Antioxidant Activity in vitro of Cardiospermum halicacabum from Guangxi

CHEN Jun1，CHEN Li1，WEI Jianhua2（1.School of Medicine，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Liuzhou 545005，China；2.School of Pharmacy，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To establish the fingerprints of 11 batches of Cardiospermum halicacabum from Guangxi，and detect its spectrum-effect relationship of antioxidant activity in vitro，and provide reference for revealing the material basis for its antioxidant activity.METHODS：HPLC was conducted to establish the fingerprints of 11 batches of C.halicacabum from Guangxi，the 1，1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine（DPPH）free radical scavenging method was used to determine the antioxidant activity in vitro of C.halicacabum from different origins，and bivariate correlation analysis was adopted to detect the spectrum-effect relationship of antioxidant activity in vitro.RESULTS：The similarities of 11 batches of C.halicacabum from Guangxi were all more than 0.9，and the content change of peak 2（protocatechuic acid），3，4，12 in 16 common peaks was closely related to the DPPH free radical scavenging activity.CONCLUSIONS：The chemical composition of C.halicacabum from different origins in Guangxi is basically consistent，while there are some differences in the quality of the producing area.The protocatechuic acid（peak 2）and the unknown compounds represented by peak 3，4，12 may be the pharmacodynamic material basis of its antioxidant activity.

Guangxi；Cardiospermum halicacabum；Antioxidant activity in vitro；Fingerprint

R932

A

1001-0408（2017）07-0906-04

2016-08-24

2016-11-06）

（編輯：林 靜）

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（No.2013YB287）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥、民族藥的有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0772-2056026。E-mail：lzyzchenjun@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.12