王安波 孫 思 楊 梅 汪 儉 劉文鋒

(黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，貴州凱里 556000)

建立牛奶中黃曲霉毒素M1含量的超高效液相快速測(cè)定法

王安波 孫 思 楊 梅 汪 儉 劉文鋒*

(黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，貴州凱里 556000)

基于GB 5413.37-2010優(yōu)化建立牛奶中黃曲霉毒素M1的測(cè)定方法，在GB 5413.37-2010第二法基礎(chǔ)上，以樣品直接離心除雜，通過免疫親和柱凈化，經(jīng)25%乙腈-水溶液洗脫定容，用超高效液相色譜儀測(cè)定，采用外標(biāo)法定量。該方法對(duì)黃曲霉毒素M1的線性范圍為0.5～16.0μg/L，R2=0.9997，最低檢測(cè)濃度為0.1μg/L，樣品中的回收率在77.7%～88.6%，RSD≤5%。該方法能對(duì)牛奶中的黃曲霉毒素M1含量進(jìn)行定性和定量分析，方法精密度、準(zhǔn)確度較高，操作快速、簡便，結(jié)果滿意。

超高效液相色譜儀 黃曲霉毒素M1牛奶

1 前言

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）主要由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生，均為二氫呋喃香豆素衍生物[1]。黃曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素，早在20世紀(jì)90年代就已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。

根據(jù)《GB 2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》我國乳及乳制品中黃曲霉毒素M1最高限量值為0.5 μg/kg[3]。常用檢測(cè)方法有免疫親和法、層析液相色譜法、免疫親和層析液-質(zhì)聯(lián)用法、免疫親和層析熒光分光度法、雙流向酶聯(lián)免疫法等[4]。本研究在GB 5413.37-2010第二法（免疫親和層析液相色譜法）的基礎(chǔ)上，采用直接離心除雜，免疫親和柱凈化后流動(dòng)相洗脫定容，用超高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量，建立了生鮮乳中黃曲霉毒素M1的快速測(cè)定方法。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

2.1.1 樣品：牛奶樣品購于當(dāng)?shù)啬膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)。

2.1.2 藥品與試劑：黃曲霉毒素M1（AFM1），標(biāo)準(zhǔn)品含量10μg/ml，Pribolab；黃曲霉毒素M1免疫親和柱（VICAM AflaTest WB）；Φ11cm中速定性濾紙（新星，中性）；乙腈為色譜純，水為超純水。

2.1.3 儀器與設(shè)備：ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜，waters公司；熒光檢測(cè)器ACQUITY FLR（帶13 μl大體積流通池），waters公司；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 um），waters公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；超聲波清洗器，上海聲彥超聲波儀器有限公司；固相萃取裝置，杭州賽析科技有限公司。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和工作液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：精密移取黃曲霉毒素M1（10μg/ml）1.00 ml置10 ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1μg/ml）。

標(biāo)準(zhǔn)品工作液：精密量取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1μg/ ml）1 ml置10 ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)工作液（100μg/L）。

2.3 樣品提取與凈化

將樣品放置至室溫（23±3 ℃）下稱量30 mL試樣，置于聚丙烯離心管中，10000 r/min下離心10 min。上清液經(jīng)中性濾紙過濾收集至少10 ml濾液為備用液。將黃曲霉免疫親和柱安裝于固相萃取裝置上，精密量取10.0 ml備用液自然過柱，用2 ml水洗，真空抽干。用2 ml乙腈（25%）-水溶液洗脫，收集洗脫液，過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜后上機(jī)分析。

2.4 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7μm），柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水（25：75），等度洗脫，流速0.20 ml/min；進(jìn)樣量2μl，保留時(shí)間3.90±0.15min，運(yùn)行時(shí)間12 min；熒光檢測(cè)器-大體積流通池；激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長429 nm。根據(jù)儀器特性及實(shí)際情況，優(yōu)化了流速及進(jìn)樣量。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將2.2中標(biāo)準(zhǔn)工作液精密量取相應(yīng)體積，用流動(dòng)相乙腈（25%）-水溶液定容至2 ml，配成濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，供液相色譜分析。按照外標(biāo)法計(jì)算得到曲線方程，Y=112919X-12833，R2=0.9997。結(jié)果如圖1所示，黃曲霉毒素M1濃度在0.5～16.0 μg/L之間呈線性關(guān)系，滿足含量測(cè)定要求。

圖1 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取牛奶空白樣品基質(zhì)30.0 ml各3份，分別添加3個(gè)不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，用外標(biāo)法做添加回收試驗(yàn).

牛奶空白基質(zhì)樣品在0.1、0.5、2.0 μg/L 3個(gè)不同濃度的黃曲霉毒素M1進(jìn)行添加回收加標(biāo)試驗(yàn)，回收率在77.7%～88.6%之間，RSD≤5%。參考《GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F，本方法允許回收率范圍為60%～120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤30%，說明該方法對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定均有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

3.3 檢出限

根據(jù)黃曲霉毒素M1限量要求，對(duì)本方法條件進(jìn)行低濃度試驗(yàn)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1μg/L時(shí)，如圖2A所示，信噪比S/N＞3，表明黃曲霉毒素M1的檢出限為0.1μg/L；對(duì)牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，當(dāng)添加濃度為0.1μg/L時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，其信噪比S/ N＞10，可以確定該方法的最低定量限為0.1μg/L，滿足乳及乳制品限量0.5μg/L要求。

圖2 0.1μg/kg黃曲霉M1液相色譜圖

3.4 樣品測(cè)定

對(duì)所抽的100份牛奶樣品進(jìn)行黃曲霉毒素M1含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為未檢出。

4 討論

4.1 前處理方法優(yōu)化

在配制黃曲霉毒素M1儲(chǔ)備液時(shí)，GB 5413.37第二法中采用三氯甲烷進(jìn)行稀釋。因考慮到三氯甲烷毒性極高且采購不便，本方法直接選擇購買液體標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈進(jìn)行稀釋定容，效果良好。

GB 5413.37第二法中采用50 ml濾液過柱，經(jīng)10 ml水洗后用4 ml乙腈洗脫并氮吹至50～500μl，用水10倍定容。在實(shí)際操作過程中，氮吹后剩余量難以精確計(jì)量，因此造成實(shí)驗(yàn)誤差較大，且操作煩瑣。本方法采用10 ml濾液過柱，2 ml水洗真空抽干，直接用乙腈（25%）-水溶液洗脫定容，操作簡便且利于控制。

4.2 上機(jī)檢測(cè)條件優(yōu)化

本試驗(yàn)回收率的關(guān)鍵在于黃曲霉免疫親和柱，因此在每批次試驗(yàn)之前都要進(jìn)行柱效驗(yàn)證。本試驗(yàn)過程中對(duì)比了三種黃曲霉免疫親和柱，其中兩種免疫親和柱柱效僅為61%～68%，難以滿足定量檢測(cè)要求。而本試驗(yàn)選用的Waters公司黃曲霉免疫親和柱經(jīng)多次試驗(yàn)，柱效均在90%以上，RSD≤5%，效果良好。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)是基于GB 5413.37第二法，以樣品直接離心除雜通過免疫親和柱凈化，經(jīng)25%乙腈-水溶液洗脫定容，用超高效液相色譜儀測(cè)定，采用外標(biāo)法定量。研究表明，該方法能對(duì)牛奶中的黃曲霉毒素M1進(jìn)行定性和定量分析，方法精密度、準(zhǔn)確度較高，操作快速、簡便，結(jié)果滿意。

[1] El Khoury A, Atoui A, Yaghi J. Analysis of aflatoxin M1 in milk and yogurt and AFM1 reduction by lactic bacteria used in Lebanese industry [J]. FoodControl,2011,22(10):1695-1699.

[2] Ren Y P, Zhang Y, Shao S L, et al. Simultaneous determination of multi component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, 1143(1-2): 48-64.

[3] GB2761-2011.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量. GB2761-2011.National food safety standard Limit level of mycotoxins in food (in Chinese).

[4] GB 5413.37-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定. GB 5413.37-2010. National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products.

王安波（1991-），男，助理獸醫(yī)師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)工作。

劉文鋒（1969-），男，農(nóng)業(yè)推廣研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)工作。