肖凌宇，李巧玲，倪孟祥，方宏清

1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；

2.安徽大學(xué) 健康科學(xué)研究院，安徽 合肥 230000

抗體Fab片段的表達(dá)與應(yīng)用研究進(jìn)展

肖凌宇1，2，李巧玲2，倪孟祥1，方宏清2

1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；

2.安徽大學(xué) 健康科學(xué)研究院，安徽 合肥 230000

目前，抗體Fab片段在癌癥、病毒感染和炎癥等疾病的診斷治療中越發(fā)重要，占抗體市場(chǎng)份額逐漸上升。相對(duì)于全長(zhǎng)抗體，抗體Fab片段具有無須N糖基化、可用原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)、分子小、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，使之成為研究的熱點(diǎn)。大腸桿菌由于遺傳背景清晰、使用廣泛、生產(chǎn)成本低，因而常作為原核表達(dá)宿主。本文綜述了大腸桿菌系統(tǒng)抗體Fab片段產(chǎn)量低的解決方法、Fab抗體的臨床應(yīng)用，并結(jié)合當(dāng)前研究現(xiàn)狀展望了Fab抗體生產(chǎn)的研究方向。

抗體Fab片段；大腸桿菌；優(yōu)化表達(dá)；Fab抗體藥物

20世紀(jì)70年代，DNA重組技術(shù)初步成熟。1982年，美國(guó)FDA通過了在大腸桿菌中重組表達(dá)的商業(yè)化人胰島素，這是第一個(gè)在大腸桿菌中生產(chǎn)的商業(yè)化生物藥物。隨著抗性標(biāo)記的發(fā)展，用原核細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白變得更為可行，F(xiàn)DA也通過了更多的生物單體。到2014年，生物藥物市場(chǎng)達(dá)1610.5億美元，已有200余種蛋白質(zhì)藥物，預(yù)計(jì)到2020年將達(dá)到2871.4億美元，所升高的市值多由迅速發(fā)展的單克隆抗體和抗體片段所帶來。

抗體片段主要包括Fab類抗體、單鏈抗體（scFV）、納米抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體。Fab類抗體也稱為抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding，F(xiàn)ab），由于其功能多樣、結(jié)構(gòu)完整，是最早開始研發(fā)并且也是研發(fā)得最為徹底的抗體片段。

抗體Fab片段的主要優(yōu)勢(shì)之一是適合在大腸桿菌中表達(dá)，而IgG全長(zhǎng)抗體由于分子大且其CH2區(qū)須糖基化修飾而主要用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)抗體Fab片段不僅成本低、周期短，而且有利于DNA重組技術(shù)高效率地引入突變，通過各種方法優(yōu)化，能在短時(shí)間內(nèi)提高抗體Fab片段的表達(dá)量、溶解度和穩(wěn)定性，且與相應(yīng)的scFv相比具有更高的抗體親和力和穩(wěn)定性。但抗體Fab片段在大腸桿菌中的表達(dá)量低是制約其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的主要因素，通過對(duì)宿主細(xì)胞、表達(dá)載體、表達(dá)條件和純化條件等進(jìn)行改造與優(yōu)化，有可能獲得基因工程抗體的高效表達(dá)。

1 Fab抗體的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

抗體Fab片段是IgG分子的抗原結(jié)合片段，是由木瓜蛋白酶對(duì)IgG進(jìn)行酶解得到，由輕鏈（VLCL）和重鏈Fd段（VH-CH1）組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為50 000，輕鏈和重鏈之間的相互作用以及二硫鍵使得Fab分子具有穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

Fab具有良好的結(jié)構(gòu)完整性和功能多樣性，而且適合在大腸桿菌中表達(dá)，周期短，成本低，因此是定向改造首選的分子形式。而全長(zhǎng)的IgG由于有Fc段，分子大，需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行糖基化修飾，表達(dá)周期長(zhǎng)，成本高，且全長(zhǎng)IgG由于分子太大而不能滲入某些組織[1]。與全長(zhǎng)IgG相比，F(xiàn)ab片段有許多特性，如沒有Fc段、合成時(shí)不需要進(jìn)行糖基化修飾、免疫原性低、不會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、結(jié)合力高、半衰期短、適合在大腸桿菌和酵母菌中表達(dá)、周期短[2]。Fab類抗體在治療眼科疾病、自身免疫疾病和癌癥上都有很好的臨床效果，因此Fab類抗體的工程研究顯得尤為重要。

2 Fab片段在大腸桿菌中的生產(chǎn)及優(yōu)化措施

抗體Fab片段主要獲取方式為化學(xué)法、酶法和基因工程法?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑作用于重鏈間二硫鍵近N端處，打開二硫鍵，獲得2個(gè)相同的單價(jià)抗原結(jié)合片段。用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和無花果蛋白酶酶切IgG全長(zhǎng)抗體，也是一種常用方法?；蚬こ谭ǐ@取功能性抗體Fab片段主要通過大腸桿菌系統(tǒng)、畢赤酵母系統(tǒng)和昆蟲系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，其中最常用的是大腸桿菌系統(tǒng)[3]。但是，抗體Fab片段在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)量低是制約其大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素，因此我們著重從大腸桿菌生產(chǎn)優(yōu)化措施進(jìn)行論述，主要包括表達(dá)宿主、表達(dá)載體、培養(yǎng)條件的選擇優(yōu)化。

2.1 宿主菌的優(yōu)化

由于Fab片段的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是由重鏈Fd段和完整輕鏈間的二硫鍵決定的，而二硫鍵的形成需要氧化性環(huán)境，因此在還原性環(huán)境的胞質(zhì)內(nèi)很難獲得功能性抗體片段，需用信號(hào)肽將輕鏈和重鏈Fd段分別引導(dǎo)到周質(zhì)腔中進(jìn)行正確折疊，因此周質(zhì)腔環(huán)境就顯得尤為重要。另外，改造菌株、共表達(dá)催化劑、在胞質(zhì)內(nèi)形成氧化環(huán)境，也是一種可選措施[4]。

表達(dá)宿主的差異對(duì)Fab總表達(dá)量的影響很顯著，主要在于宿主菌中某些蛋白酶尤其是周質(zhì)蛋白酶或外膜蛋白相關(guān)基因。宿主本身的蛋白酶對(duì)外源蛋白有降解作用，外膜蛋白相關(guān)基因缺失能夠?qū)ab片段更多地釋放到培養(yǎng)基中，更有利于純化，在生產(chǎn)中有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

有研究表明，硫氧還蛋白酶（TrxB）及谷胱甘肽還原酶（Gor）缺乏的大腸桿菌菌株更易提供一個(gè)Fab分子正確折疊表達(dá)的氧化環(huán)境，有利于二硫鍵的產(chǎn)生，使蛋白分泌表達(dá)，提高蛋白活性。FA113菌株[5]是Novagen公司改造的相關(guān)工程菌株，在普通搖瓶中Fab的產(chǎn)量就能達(dá)到10～30 mg/ L。而Levy等[6]使用的DE3菌株是Lon周質(zhì)蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷的大腸桿菌菌株，表達(dá)抗體Fab片段的產(chǎn)量比FA113更高。更為具體的研究表明，F(xiàn)ab片段中輕鏈的降解與degp、prc基因有關(guān)，degp和prc編碼的蛋白酶可降解未折疊的輕鏈蛋白。敲除輕鏈裂解基因degp、pcr，并引入prc的抑制基因spr突變，能夠最大限度地抑制輕鏈的裂解，而且對(duì)宿主生長(zhǎng)不會(huì)有影響，在高密度表達(dá)抗體Fab片段時(shí)表達(dá)量能夠達(dá)到10 000 mg/L，因此是提高目的蛋白Fab產(chǎn)量的有效策略[2]。但很少有人在用作底盤生物的最小基因組的大腸桿菌中表達(dá)過Fab抗體。朱美勤等[7]以前的研究結(jié)果表明不同程度的基因組刪減菌在耐酸性和番茄紅素的表達(dá)能力上的確有一些差異，因此，他們致力于尋找最適程度的刪減菌，并在此基礎(chǔ)上敲除相關(guān)的周質(zhì)蛋白酶，以更大程度地提高重組蛋白抗體Fab片段的表達(dá)量。

Chen等[8]發(fā)現(xiàn)敲除大腸桿菌桿中mrcA、mrcB、pal、lpp基因中的1個(gè)或2個(gè)，能夠提高目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中的水平。在相同培養(yǎng)條件下，mrcA和lpp同時(shí)敲除比不敲除的DE3大腸桿菌分泌表達(dá)高88.9%，只敲除lpp的比不敲除的表達(dá)高71.1%，表明lpp外膜蛋白基因?qū)τ谀康牡鞍椎臐B漏表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。在編碼區(qū)或啟動(dòng)子處引入lpp突變，能夠很好地將周質(zhì)中的Fab片段分泌到培養(yǎng)基中[9]。用omp、tol、excD、excC、lpp、env和lky的組合突變，全長(zhǎng)抗體能夠釋放到培養(yǎng)基中[10]。過表達(dá)細(xì)菌素釋放蛋白基因kil會(huì)引發(fā)細(xì)胞裂解，細(xì)菌釋放蛋白BRP能在細(xì)胞外膜形成可滲透性區(qū)域，目的蛋白能分泌進(jìn)入培養(yǎng)基[11]。但這些通過改造外膜而使目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中的改造菌株的穩(wěn)定性不好，無法進(jìn)行高密度培養(yǎng)，因此要進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)還須深入研究。

2.2 表達(dá)載體的選擇

選擇表達(dá)載體時(shí)要從啟動(dòng)子、復(fù)制子、選擇性標(biāo)簽和融合蛋白表達(dá)序列等方面出發(fā)，須選擇合適的表達(dá)元件組合進(jìn)行Fab片段的表達(dá)。

2.2.1 復(fù)制子的選擇 復(fù)制子的選擇在于拷貝數(shù)。一般情況下可以認(rèn)為高拷貝數(shù)的質(zhì)粒意味著更高的蛋白表達(dá)量。但是，大量質(zhì)粒給大腸桿菌更多的代謝壓力，繼而降低大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖速率，目的蛋白的表達(dá)量也因此減少。因此拷貝數(shù)高并不代表著高的蛋白表達(dá)[12]。

常用的載體是pET系列，帶有pMB1起始位點(diǎn)（由ColE1衍生，每個(gè)細(xì)胞15～60個(gè)拷貝[13]）；pUC系列載體中包含改造的pMB1起始位點(diǎn)，高拷貝數(shù)為500～700個(gè)[14]；pQE載體含有野生型ColE1起始位點(diǎn)，約15～20個(gè)拷貝。這些載體都屬于同一類不兼容載體，相互競(jìng)爭(zhēng)的復(fù)制機(jī)制，不能在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)增殖[15]。2個(gè)質(zhì)粒一同表達(dá)的雙表達(dá)載體，一般p15A為起始位點(diǎn)（pACYC和pBAD系列質(zhì)粒中含有）是能夠兼容的[16]。雖不多見，3個(gè)載體共同表達(dá)能夠通過pSC101載體實(shí)現(xiàn)，這個(gè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)相對(duì)較低（每個(gè)細(xì)胞小于5個(gè)拷貝）。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒有利于克隆基因的高劑量或該表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的情況[17]?；蛘?，Duet載體的使用通過將2個(gè)基因克隆在同一個(gè)質(zhì)粒上簡(jiǎn)化了共同表達(dá)過程。Duet質(zhì)粒有2個(gè)多克隆位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都含有T7啟動(dòng)子、lac控制子和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)。通過結(jié)合不同的兼容性Duet載體，能夠?qū)崿F(xiàn)8個(gè)重組蛋白在4個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中的同時(shí)表達(dá)。

2.2.2 啟動(dòng)子的選擇 在蛋白表達(dá)時(shí)，需要一個(gè)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子來控制高水平的表達(dá)，同時(shí)要盡量避免基礎(chǔ)表達(dá)。目前，大腸桿菌中使用較多的有l(wèi)ac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子。lac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控，可由乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄。trc啟動(dòng)子是trp和lac的拼合啟動(dòng)子，比trp和lac啟動(dòng)子具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率和啟動(dòng)子特性?，F(xiàn)實(shí)中為了能嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乇磉_(dá)調(diào)控產(chǎn)物，常選擇lac/tac/trc復(fù)合表達(dá)系統(tǒng)的菌株。以上啟動(dòng)子均是由IPTG誘導(dǎo)激活的。

T7表達(dá)系統(tǒng)由于其強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄效率，成為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流。T7啟動(dòng)子是由T7 RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)的，高活性的T7 RNA聚合酶可由另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)，大多數(shù)情況是整合在宿主菌基因組上。IPTG誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶的表達(dá)，因此可通過控制誘導(dǎo)條件繼而控制目的蛋白的表達(dá)量，以避免目的蛋白表達(dá)過多過快，堵塞蛋白分泌通道，影響最終的分泌表達(dá)水平[18]。

還有溫度敏感型啟動(dòng)系統(tǒng)，如突變的λcI抑制蛋白λcI857，該抑制蛋白在37℃以上非常不穩(wěn)定。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常在28～30℃進(jìn)行高密度培養(yǎng)，隨后將溫度提高到40～42℃，抑制蛋白失效，λcI啟動(dòng)子激活，大量表達(dá)目的蛋白[19]。另一個(gè)溫度誘導(dǎo)型蛋白為冷激蛋白cspA，在15℃時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能達(dá)到較高的可溶蛋白表達(dá)水平[20]。

對(duì)于Fab的生產(chǎn)表達(dá)，需要選擇的啟動(dòng)子的強(qiáng)度應(yīng)盡量與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力保持一致，否則表達(dá)過強(qiáng)會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而影響最終蛋白產(chǎn)量。

2.3 載體設(shè)計(jì)（目的基因序列）

目的基因序列是影響表達(dá)水平的關(guān)鍵因素，輕鏈和重鏈的位置順序不同，表達(dá)水平差異很大。經(jīng)典的載體設(shè)計(jì)方式是基于同一個(gè)啟動(dòng)子，加上輕重鏈各自的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，在重鏈和輕鏈的N端都加上各自的信號(hào)肽序列以將重鏈、輕鏈分別引導(dǎo)入周質(zhì)腔進(jìn)行正確折疊。

信號(hào)肽的選擇主要基于翻譯起始區(qū)（TIR）的強(qiáng)度。TIR的核苷酸序列與信號(hào)肽序列重疊，因此優(yōu)化信號(hào)肽能夠改善TIR的強(qiáng)度，提高目的蛋白的產(chǎn)量。常用的信號(hào)肽為果膠裂解酶B（pelB）和主要外膜蛋白A（ompA）、堿性磷酸酶（phoA）、STII、DsbA、PhoA、MalE等。在大腸桿菌中表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF165）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NFG）、人轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）分泌型蛋白時(shí)，表現(xiàn)出相對(duì)TIR強(qiáng)度較低時(shí)，目的蛋白表達(dá)量越高[21]。在TIR強(qiáng)度一致時(shí)，信號(hào)肽中H區(qū)疏水性的強(qiáng)度越高，越能將分泌相對(duì)受限的重鏈引導(dǎo)進(jìn)入周質(zhì)腔，進(jìn)而提高表達(dá)水平。因?yàn)镠區(qū)疏水性提高能夠改變抗體的分泌途徑，更傾向于共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，阻止HC在細(xì)胞質(zhì)中的聚集[22]。

因此，選擇合適的信號(hào)肽對(duì)高水平分泌表達(dá)非常重要。有學(xué)者研究輕重鏈及信號(hào)肽的順序問題，發(fā)現(xiàn)在3種排列組合中，pelB+LC+ompA+HC的構(gòu)建形式時(shí)周質(zhì)表達(dá)量最高[23]。我們?cè)黾恿伺帕薪M合方式，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)組合為pelB+HC+pelB+LC，并且在其他排列順序基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)ompA信號(hào)肽突變能夠帶來更高的表達(dá)量（結(jié)果尚未發(fā)表），這表明不同的目的蛋白序列所對(duì)應(yīng)的表達(dá)序列不同。

Humphreys等[24]構(gòu)建了雙啟動(dòng)子的噬菌體篩選表達(dá)載體，在輕重鏈之前都有一個(gè)tac啟動(dòng)子，并且第2個(gè)tac啟動(dòng)子是經(jīng)過改造的，以平衡重輕鏈的表達(dá)。Leonard等[25]在2個(gè)相兼容的載體中分別表達(dá)輕鏈和重鏈，在抗性壓力下在同一個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和組裝。

除了用信號(hào)肽把重輕鏈引導(dǎo)入周質(zhì)，還有一些可在胞質(zhì)中表達(dá)的方法。由于細(xì)胞質(zhì)中為還原環(huán)境，無法合成二硫鍵，因此都是分泌到周質(zhì)腔中進(jìn)行正確折疊，可采取與目的蛋白載體共表達(dá)氧化型催化劑的措施，在胞質(zhì)中形成氧化環(huán)境，胞內(nèi)表達(dá)水平要遠(yuǎn)高于分泌表達(dá)，在13種小分子抗體中都有相對(duì)高的表達(dá)水平[4]。

在載體上適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)融合共表達(dá)標(biāo)簽更有利于Fab的表達(dá)、檢測(cè)和純化。在表達(dá)scFv小分子抗體時(shí)，加上MBP[26]和SUMO[27]標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣吣康牡鞍椎目扇苄员磉_(dá)。Czerwinski等[28]在表達(dá)抗體Fab片段時(shí)，在pComb3H載體上同時(shí)表達(dá)生物素羧基載體蛋白（BCCP），能夠結(jié)合生物素受體又能識(shí)別人血型糖蛋白A，因此可以用親和素標(biāo)記的熒光素或酶代替二抗，檢測(cè)生物素化的Fab，同時(shí)純化時(shí)也可用親和素柱。

2.4 分子伴侶的選擇

由于強(qiáng)啟動(dòng)子的作用，宿主菌本身的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，目的蛋白表達(dá)水平往往較高，宿主菌自身的分子伴侶無法滿足肽鏈的正確折疊，因此會(huì)形成包涵體。引入外源分子伴侶以輔助目的蛋白的正確折疊，是一種提高活性蛋白產(chǎn)量增加活性蛋白的思路。

Lobstein等[29]發(fā)現(xiàn)，將二硫鍵異構(gòu)酶DsbC片段插入trxB gor敲除的突變宿主菌的染色體，能夠輔助目的蛋白Fab片段在胞質(zhì)中的高效折疊。除了二硫鍵異構(gòu)酶因DsbC，二硫鍵氧化還原酶DsbA及具有分子伴侶活性的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶FkpA和SurA都有促進(jìn)目的蛋白分子正確折疊的作用。Levy等[30]比較了不同分子伴侶對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響，證明Skp比GroEL/ES、DnaK/J和DsbC的輔助活性更大，能達(dá)到最大產(chǎn)量0.8 mg Fab/（L·D600nm），然而DsbC在其他研究中被證明為輔助活性最大的分子伴侶，因此可以推測(cè)，每個(gè)目的蛋白有其最適合的共表達(dá)分子伴侶，需要通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Martin等[31]構(gòu)建了輔助質(zhì)粒pTUM4，其中帶有DsbC、DsbA、FkpA和SurA這4種能輔助目的蛋白正確折疊的分子伴侶，結(jié)果表明這4種分子伴侶的共同過表達(dá)不僅能提高重組蛋白的產(chǎn)量，還能提高細(xì)胞穩(wěn)定性。

2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

大腸桿菌生產(chǎn)出的Fab抗體其分泌位置與培養(yǎng)條件有密切關(guān)系。特定的培養(yǎng)條件能夠使Fab分子更多分泌表達(dá)到上清中，可能是因?yàn)镕ab分子在周質(zhì)腔中的大量積累使菌體破裂，也可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基或培養(yǎng)溫度的原因使大腸桿菌外膜的通透性增加。

2.5.1 培養(yǎng)溫度的選擇 低溫不僅能增加抗體Fab片段的表達(dá)量，還能提高蛋白的可溶性表達(dá)，由于低溫時(shí)培養(yǎng)基中的氧溶量會(huì)增加，避免厭氧菌體生長(zhǎng)而產(chǎn)生對(duì)目的蛋白表達(dá)有抑制作用的乙酸的產(chǎn)生。另外，質(zhì)粒穩(wěn)定性也會(huì)隨著抗生素半衰期的延長(zhǎng)而增加。較低溫度會(huì)使目的蛋白降解的相關(guān)酶活性降低，提高可溶蛋白的穩(wěn)定性。低溫時(shí)，目的蛋白合成速率也減慢，向周質(zhì)或培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)運(yùn)速度也相應(yīng)變小，不易阻塞通道，不會(huì)給細(xì)菌帶來太大的負(fù)擔(dān)[32]。3H6 Fab在大腸桿菌周質(zhì)中分泌，37℃時(shí)胞外分泌率為40%，30℃時(shí)則高至70%，且總產(chǎn)量也有明顯提高[33]。

2.5.2 轉(zhuǎn)速的選擇 Ukkonen等[34]比較了不同宿主菌、培養(yǎng)基、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速及通氧量的情況下Fab片段的總產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)速對(duì)Fab最終產(chǎn)量的影響較大。在同一種培養(yǎng)基中，150 r/min轉(zhuǎn)速時(shí)的胞外滲透率為75%，遠(yuǎn)高于250 r/min時(shí)的2%～17%。而且他們也證明了低通氧量會(huì)促進(jìn)Fab的胞外分泌。

2.5.3 培養(yǎng)基的選擇 抗體Fab片段生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的成分對(duì)于可溶性表達(dá)有著重要的影響。有豐富金屬離子和鹽離子的緩沖溶液更有利于Fab表達(dá)，特別是可溶性表達(dá)。金屬離子能夠幫助輔助折疊的酶類形成二硫鍵，增加可溶蛋白的表達(dá)量[35]。如今用的較多的培養(yǎng)基有自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分批補(bǔ)料葡萄糖培養(yǎng)基、甘油培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)相同的時(shí)間后，不管是細(xì)胞密度還是Fab產(chǎn)量，自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基都有較大優(yōu)勢(shì)[36]。

3 Fab抗體純化方法

除了構(gòu)建較優(yōu)載體提高Fab抗體的表達(dá)量，改進(jìn)純化工藝提高純化效率也能提高Fab的產(chǎn)量。最常見的純化方法是在Fab目的基因的輕鏈或重鏈上加上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，然后通過親和層析將目的蛋白固定到含有Fab抗抗體的吸附柱上，最后用洗脫液洗脫下來。蛋白A、蛋白G[37]、蛋白L[38]正是幾種這樣的吸附柱，但對(duì)IgG的吸附是特異的，而Fab片段缺少Fc段，蛋白A、G與IgG的Fc段結(jié)合，只與Fab的亞單位結(jié)合，因此不具有普遍性。蛋白L可與κ輕鏈可變區(qū)結(jié)合。也可在載體上插入親和素標(biāo)簽（BCCP），純化時(shí)用親和素柱，簡(jiǎn)單高效[23]。

Ashwini等[39]采用優(yōu)化的一步純化法對(duì)目的蛋白Fab片段進(jìn)行純化。首先用親硫?qū)游龀ゴ竽c桿菌污染物，目的蛋白純化物會(huì)直接進(jìn)入鎳親和柱中，最終純度可達(dá)99%。Nesbeth等[40]發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)周質(zhì)核酸酶和目的Fab片段能夠在細(xì)胞破碎后自動(dòng)降解大腸桿菌基因組，從而減少基因組污染及原料的黏稠度，簡(jiǎn)化后期純化流程。在共表達(dá)時(shí)，高密度發(fā)酵培養(yǎng)后，產(chǎn)量可達(dá)0.7 g/L，遠(yuǎn)高于Fab片段單獨(dú)表達(dá)，而且產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)比單獨(dú)表達(dá)提前8～10 h，大大節(jié)約了時(shí)間成本。

4 Fab抗體片段的臨床應(yīng)用

在一些臨床應(yīng)用中，抗體片段比完整的抗體更加有優(yōu)越性。其中一個(gè)優(yōu)越性是片段抗體比完整抗體分子小，能夠進(jìn)入全長(zhǎng)抗體進(jìn)不去的組織中發(fā)揮治療作用以及進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色?？贵w片段比常規(guī)抗體更小，通常沒有被糖基化，可以使它們的產(chǎn)物在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，從而節(jié)省時(shí)間和資金消耗。然而，缺少Fc結(jié)構(gòu)域的片段在體內(nèi)比常規(guī)抗體降解速度快，不會(huì)激發(fā)Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，而且由于減少了抗體與Fc受體的非特異性結(jié)合，對(duì)免疫組化和其他檢測(cè)更有利。但同時(shí)也是因?yàn)槿鄙貴c域，比全長(zhǎng)抗體降解速度快，半衰期只有2～3 h，有研究將Fab聚乙二醇化，能夠延長(zhǎng)其半衰期。

隨著對(duì)Fab片段研究的深入，在預(yù)防、診斷和治療領(lǐng)域有了廣泛應(yīng)用。有些Fab抗體藥物已通過FDA審查進(jìn)入市場(chǎng)，有些仍處于臨床試驗(yàn)階段。以下按照Fab治療疾病的種類分類介紹。

4.1 自身免疫性疾病

4.1.1 治療紅斑狼瘡 抗體片段CD7657是具有高親和力的聚乙二醇Fab'，屬抗人CD40L種類，能夠治療紅斑狼瘡，且避免了抗人CD40L IgG1抗體hu5c8會(huì)形成血栓的副作用。由于其缺少Fc段，不會(huì)激活血小板并保留有藥理活性[41]。該抗體片段已進(jìn)入臨床階段，選取28名健康人員和17名狼瘡患者進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)及安全性研究，結(jié)果證明治療效果良好，且輕度不良反應(yīng)中均無血栓現(xiàn)象。

4.1.2 治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 賽妥珠單抗酯[42]是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的單抗，已獲FDA批準(zhǔn)，與TNF-α受體結(jié)合。雖然臨床數(shù)據(jù)表明賽妥珠單抗在安全性和有效性上并不比其他抗TNF-α的抗體有更多優(yōu)勢(shì)，但將抗TNF-αFab抗體片段PEG化后，半衰期從幾個(gè)小時(shí)延長(zhǎng)到2周，而且與其他全長(zhǎng)抗體不同，沒有Fc段，可以用原核系統(tǒng)表達(dá)，具有重大意義。

4.2 診斷腫瘤

美妥昔單抗I是成都華神集團(tuán)高新技術(shù)產(chǎn)品，是已獲我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)用于治療肝癌的抗CD147F（ab）2。

抗體片段Fab LH-7是通過構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)篩選出的對(duì)乳腺癌診斷具有高活性且預(yù)后良好的Fab抗體，對(duì)于乳腺癌的診斷和治療提供了新思路和前景[43]。

Tsumura等[44]通過研究大多數(shù)癌癥中都會(huì)分泌的TF因子，篩選了1849種單克隆抗體及1849種Fab單抗片段，以選出可用于癌癥診斷和治療的合適的抗體。結(jié)果表明1849-Fab比1849-IgG具有更快與抗原結(jié)合的能力，并有更快的清除率，不易發(fā)生持續(xù)高腫瘤累積。

阿斯利康公司的ZD-2767C是將抗癌胚抗原F（ab'）2融合到羧肽酶G2上，將其作為癌癥前體藥物治療中的抗體酶，現(xiàn)正進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

4.3 地高辛解毒劑

地高辛強(qiáng)心苷用量過多易致死，地高辛免疫Fab可用于治療慢性或急性地高辛中毒。最新的研究中使用地高辛免疫Fab成功治愈了椰子蟹中毒患者[45]。

4.4 眼科疾病

雷尼珠單抗（ranibizumab/Lucentis）由羅氏公司研制，2006年由FDA批準(zhǔn)上市，用于治療黃斑病變。2012年8月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了雷尼珠單抗注射劑的一個(gè)新適應(yīng)證，即糖尿病性黃斑水腫導(dǎo)致的視力損害。

目前雷尼單抗適用于以下疾?。盒律埽瘢┠挲g相關(guān)黃斑退行性變性（AMD）、視網(wǎng)膜血管閉塞（RVO）后黃斑水腫、糖尿病黃斑水腫（DME）。它通過抑制人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞，表達(dá)于大腸桿菌周質(zhì)腔，生產(chǎn)成本低。給藥方式為玻璃體注射，其快速穿透力和流動(dòng)性能夠促進(jìn)局部給藥，最高限度地發(fā)揮藥效，能夠改善患者視力，提高患者生活質(zhì)量。貝伐珠單抗是IgG全長(zhǎng)抗體，同樣能夠結(jié)合VEGF-A抗原，但在臨床試驗(yàn)的靜脈注射中表現(xiàn)出嚴(yán)重的不良反應(yīng)，局部給藥的Fab片段有顯著優(yōu)勢(shì)。

5 結(jié)語

Fab抗體片段相比于全長(zhǎng)抗體的優(yōu)勢(shì)使其越發(fā)受到關(guān)注，應(yīng)用范圍越來越廣，從治療腫瘤到免疫性疾病到眼科疾病，而作為示蹤診斷劑也有不錯(cuò)的效果。

通過基因工程方法在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過分子水平優(yōu)化，如增加分子伴侶獲得正確折疊產(chǎn)物，改造基因缺失的宿主菌，或培養(yǎng)條件的優(yōu)化，技術(shù)不斷成熟，能夠獲得表達(dá)產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低的Fab抗體藥物。不同程度的大腸桿菌基因組刪減菌在我們的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高于野生菌的表達(dá)水平，這也為后期基因工程改造生產(chǎn)Fab抗體提供了新思路。同時(shí)，其他替代性生產(chǎn)抗體的方法也已進(jìn)入試驗(yàn)階段，如用酵母、無細(xì)胞系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)表達(dá)Fab片段，將會(huì)比大腸桿菌系統(tǒng)成本更低，表達(dá)量更高。

小分子抗體是抗體藥物的未來發(fā)展趨勢(shì)，F(xiàn)ab抗體、scFv抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、mini抗體都表現(xiàn)出不同程度的抗原親和性。如Vandenbroucke等[46]將含有抗TNF的納米抗體基因整合到乳酸桿菌基因組，因此人們?cè)陲嬘盟崮痰耐瑫r(shí)就能治療腸炎。未來小分子抗體藥物的應(yīng)用可能會(huì)優(yōu)于全長(zhǎng)抗體，在診斷治療方面會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用。

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Advances in the Expression and Application of Antibody Fragment Fab

XIAO Ling-Yu1,2,LI Qiao-Ling2,NI Meng-Xiang1*,FANG Hong-Qing2*

1.School of Science&Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;
2.School of Health Science Research,Anhui University,Hefei 230000;China

*Co-corresponding authors,NI Meng-Xiang,E-mail:nimx_2000@aliyun.com;FANG Hong-Qing,E-mail:fanghongqing@vip.sina.com

Currently,antibody fragment Fab play major role in treating a wide variety of human diseases including cancer,viral infection inflammation as well as immune disease.The market of Fab fragment is gradually growing.Compared to full-length antibodies,low molecular weight and low immunogenicity and alternative system of prokaryotic distribute the antibody fragment to hot spot of study.Escherichia coliis chosen to be the host bacteira because of its clear genetic background,extensive use and low production cost.In this review,we highlighted recent significant progress in the engineering ofE.colifor enhanced production of functional Fab by overcome some of the limitations of the bacterial production system.We also summraized some clinical application of Fab antibodies and proposed some orientation for future research on Fab engineering combined with current research progress.

antibody fragment Fab;Escherichia coli;optimized expression;Fab antibody drug

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）03-0397-08

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.031

2017-01-06

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2011CBA00800）

肖凌宇（1993-），女，碩士研究生，（E-mail）ylx1513@163.com

倪孟祥，（E-mail）nimx_2000@aliyun.com；方宏清，（E-mail）fanghongqing@vip.sina.com