李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

載體介導(dǎo)的幽門螺桿菌NAP疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

幽門螺桿菌感染可引起胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤及胃癌等疾病，采用疫苗防治該菌是當(dāng)前研究的熱點領(lǐng)域之一。中性粒細(xì)胞激活蛋白（NAP）是一種有效的疫苗候選分子，我們簡要綜述了鼠傷寒沙門菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌和麻疹病毒等載體介導(dǎo)的幽門螺桿菌NAP疫苗的研制現(xiàn)狀。

幽門螺桿菌；中性粒細(xì)胞激活蛋白（NAP）；疫苗

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染可引起胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤和胃癌等疾病，1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將Hp列為Ⅰ類致癌原。Hp治療常采用氨芐青霉素和甲硝唑等抗生素、鉍劑等胃黏膜保護(hù)劑，以及奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑的三聯(lián)或四聯(lián)療法，但存在患者依從性差、費用高昂、再次感染、藥物副作用或耐藥等諸多問題，使得研制疫苗防治Hp感染成為當(dāng)前研究的熱點之一。

中性粒細(xì)胞激活蛋白（neutrophil-activating protein，NAP）是一種鐵蛋白，其單體的相對分子質(zhì)量為17 000，可聚集為150 000的十二聚體。NAP位于Hp菌體內(nèi)，通過自溶釋放后，與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的外膜相結(jié)合，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與胃上皮細(xì)胞黏附，然后通過G蛋白的作用使細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，激活絲氨酸激酶和PL3-K激酶，然后激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的NADPH酶，誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，從而造成胃黏膜的炎性反應(yīng)。LTK63是大腸埃希菌不耐熱腸毒素（LT）經(jīng)過基因突變用賴氨酸代替第63位色氨酸，是一種較好的免疫佐劑。Stain等[1]將NAP加LTK63口服免疫小鼠可對抗Hp攻擊，保護(hù)力達(dá)80％（8/10）。高原等[2]將150μg重組LTB-NAP融合蛋白灌胃免疫BALB/c鼠，初次免疫后1、2和3周加強(qiáng)3次，末次免疫后1周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和胃小腸液sIgA升高，這些資料表明NAP具有較好的免疫原性，是一種有希望的疫苗分子。

細(xì)菌和病毒等病原體通常對人體具有一定的致病性，應(yīng)用化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)突變它們的致病基因，可降低其毒性，但保留了它們對黏膜的侵襲力。將減毒病原體作為疫苗傳遞載體，就是利用它們穿透宿主細(xì)胞的能力，將疫苗抗原運載至抗原提呈細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答。隨后人們構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌和麻疹病毒等病原體的減毒株，這些減毒株均可成為有希望的疫苗載體。我們擬就這些載體介導(dǎo)的幽門螺桿菌NAP疫苗的研制現(xiàn)狀做簡要綜述。

1 重組鼠傷寒沙門菌疫苗

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，St）的減毒株主要用于傷寒和副傷寒的免疫預(yù)防。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為將St減毒株發(fā)展成為多價疫苗載體打下了堅實的基礎(chǔ)。隨后人們構(gòu)建了大量St減毒株，如伴腺苷酸環(huán)化酶（cya）、CAMP受體蛋白（crp）和天冬氨酸β半醛脫氫酶（asd）基因缺失的營養(yǎng)缺陷性突變株，以及伴芳香族氨基酸（aro）基因缺失的營養(yǎng)缺陷性突變株等，這些St減毒株均是2個或多個基因位點的精確突變，因而其基因型和表型均很穩(wěn)定，可用作重組多價疫苗的表達(dá)載體[3-5]。焦志勇等[6]以幽門螺桿菌SS1株DNA為模板擴(kuò)增450bp的NAP基因，插入pTrc99A得pTrc-NAP，將其轉(zhuǎn)化LB5000進(jìn)行甲基化修飾后，再電穿孔轉(zhuǎn)化SL3261株，篩選培養(yǎng)，免疫印跡證實兔抗Hp血清識別重組菌表達(dá)的相對分子質(zhì)量為15 000的NAP；將1×107CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，免疫后4周口服1×107CFU幽門螺桿菌SS1株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周發(fā)現(xiàn)免疫組的胃組織Hp負(fù)荷顯著低于對照組。

孫波等[7]以幽門螺桿菌SS1株DNA為模板擴(kuò)增435bp的NAP基因，插入pBT得pBT-NAP，與pIRES重組得pIRES-NAP，將其轉(zhuǎn)化LB5000進(jìn)行甲基化修飾后，再電穿孔轉(zhuǎn)化SL7207，篩選培養(yǎng)，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)重組菌表達(dá)15 000的NAP；將1×109CFU的幽門螺桿菌SS1株口服感染BALB/c鼠，感染后30周用1×109CFU疫苗灌胃進(jìn)行免疫治療，治療后1、2周加強(qiáng)2次，末次免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG滴度為1∶32 768，免疫組的保護(hù)力可達(dá)75％（3/4）,而對照組的保護(hù)力為0（0/4）。

2 重組乳酸乳球菌疫苗

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，LL）是乳制品工業(yè)發(fā)酵的重要菌類，也是一種有希望的疫苗載體[8]。乳球菌的細(xì)胞壁厚且復(fù)雜，攝取外源DNA較為困難。Kim等[9]用電穿孔方法進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化乳酸桿菌的試驗，摸索出了較好的轉(zhuǎn)化條件，為構(gòu)建重組乳球菌疫苗提供了便利。為了將外源DNA有效引入乳球菌，常需要構(gòu)建誘導(dǎo)型大腸桿菌-乳球菌穿梭表達(dá)載體，它可利用誘導(dǎo)劑對外源蛋白進(jìn)行可控性表達(dá)。Ruyter等[10]開發(fā)了乳菌肽控制的表達(dá)系統(tǒng)（nisin-controlled expres?sion system，NICE）。通常將含有nisA啟動子的質(zhì)粒導(dǎo)入攜帶nisR和nisK蛋白基因的宿主菌時，外源基因的表達(dá)較弱，當(dāng)在對數(shù)生長期加入乳菌肽進(jìn)行誘導(dǎo)后，外源基因的表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)與乳菌肽的劑量成正比，誘導(dǎo)效率可以達(dá)到1000倍以上[11]。李建芳等[12]以幽門螺桿菌的26695株DNA為模板擴(kuò)增435bp的NAP基因，插入pNICE-SEC得pNICE-NAP，將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，20ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)6h，SDS-PAGE證實重組菌可表達(dá)17 000的NAP；免疫印跡表明兔抗Hp血清識別重組菌表達(dá)的NAP；將5×109CFU疫苗口服免疫ICR鼠，初次免疫后1、2、9、16、23和30d加強(qiáng)6次，末次免疫后2周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和腸sIgA升高，滴度分別為1∶1000和1∶50，但未進(jìn)行保護(hù)力的研究。

3 重組枯草芽孢桿菌疫苗

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）自身沒有致病性，在極端條件下，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源孢子即芽孢。Cutting等[13]發(fā)現(xiàn)該菌的芽孢可分為核、皮層、內(nèi)層和外層等結(jié)構(gòu)；Chada等[14]發(fā)現(xiàn)芽孢外層的芽孢衣蛋白CotC、CotB及CotX具有一定的伸縮性，可延長或縮短，這對于芽孢的形成和萌發(fā)，以及芽孢表面呈現(xiàn)外源抗原具有重要作用。Tam等[15]認(rèn)為該菌的芽孢能夠在人體胃腸道內(nèi)萌發(fā)和形成芽孢；Duc等[16]發(fā)現(xiàn)該菌的芽孢不僅可在其表面融合表達(dá)外源抗原，還可在芽孢萌發(fā)后，在繁殖體內(nèi)表達(dá)外源抗原，提示該菌的芽孢是一種有希望的疫苗載體。Shih等[17]以Hp 26696株的基因組DNA擴(kuò)增NAP編碼基因，將其插入pCR4-TOPO得pCR4-NAP，與pET28α重組得pET28α-NAP，與 pRAP重組得 pRAP-NAP，電穿孔轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DB104株，篩選重組菌，培養(yǎng)后經(jīng)SDS-PAGE證實重組菌可表達(dá)17 000的Hp-NAP，免疫印跡表明抗Hp-NAP的鼠血清可識別Hp-NAP重組蛋白，生物學(xué)試驗表明該重組蛋白可誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)氧等活性產(chǎn)物。

4 重組麻疹病毒疫苗

人們發(fā)現(xiàn)麻疹病毒的減毒株Schwarz是有效的疫苗載體，可有效表達(dá)多種外源抗原[18-20]。Iankov等[21-23]以麻疹病毒26695株的DNA為模板擴(kuò)增 NAP基因，插入p（+）MVeGFP得p（+）MVNAP，與MV-lambda重組得MV-NAP，將其轉(zhuǎn)化麻疹病毒減毒株Schwarz后，再轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞Vero株，篩選培養(yǎng)96h，免疫印跡發(fā)現(xiàn)鼠抗NAP的單抗識別重組病毒表達(dá)的NAP；將1×106PFU重組病毒腹腔注射免疫IFN-rR-/-CD46-/-基因敲除鼠，發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG在免疫后4～21d升高，21d達(dá)較高水平；免疫酶斑點試驗證實在免疫后35d脾IFN-γ+分泌細(xì)胞的數(shù)目顯著增加；隨后將2×105PFU重組病毒接種IFN-rR-/-CD46-/-基因鼠，免疫后18、30和180d免疫鼠的血清IgG滴度分別為1∶102 400、1∶512 000和1∶409 600，免疫后4周免疫鼠的血清IgG1、IgG2a和IgG2b升高，IgG2a與IgG1比值大于1。最后將1×106的MBA231-lu-P4乳腺癌細(xì)胞株靜脈注射無胸腺的裸鼠建立小鼠乳腺癌擴(kuò)散模型，建模后6d靜脈注射1×106PFU重組病毒進(jìn)行免疫治療，每天1次，連續(xù)10d，末次免疫治療后9d發(fā)現(xiàn)治療鼠的血清IL-6升高，胸液TNF-α、IL-6和IL-23升高，治療鼠的生存時間顯著高于未治療鼠。

5 結(jié)語

盡管大部分現(xiàn)有載體介導(dǎo)的幽門螺桿菌NAP疫苗可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)性免疫應(yīng)答，但它們產(chǎn)生的保護(hù)力通常較低，遠(yuǎn)未達(dá)到人們所期望的水平。同時還發(fā)現(xiàn)，重組鼠傷寒沙門菌疫苗的表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白存在差異，表達(dá)水平較低；重組乳酸乳球菌疫苗易于培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好,但長期低劑量口服該疫苗有可能誘導(dǎo)免疫耐受[24]；重組枯草芽孢桿菌疫苗含有大量胞內(nèi)和胞外的蛋白水解酶，使外源蛋白無法穩(wěn)定存在，同時它還缺乏蛋白修飾系統(tǒng)，不能高效合成真核蛋白；重組麻疹病毒的安全性和有效性值得進(jìn)一步關(guān)注。

隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，將會促進(jìn)對幽門螺桿菌的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀遺傳學(xué)等進(jìn)行深入研究，從而闡明Hp的生物學(xué)特性及其致病機(jī)理，弄清幽門螺桿菌抗原的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，尋找有效的疫苗分子，篩選合理的抗原組合，探索合適的載體系統(tǒng)和安全有效的疫苗佐劑，制訂有效的免疫接種方案，尋找能客觀反映人體免疫狀況的動物模型，選擇更為確切的免疫保護(hù)力評價指標(biāo)，制訂規(guī)范的疫苗評價體系。相信隨著這些問題的闡明，必將推動載體介導(dǎo)的幽門螺桿菌NAP疫苗研究躍上一個新的臺階。

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Research Status of NAP Vaccine Against Helicobacter pylori Mediated by Vectors

LI Wen-Gui*,CHEN Ya-Tang
Institute of Infectious and Parasitic Diseases,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongq?ing 400016,China
*Corresponding author,E-mail:cqliwengui@163.com

Helicobacter pylori infection may cause dieaseses such as chronic gastritis,peptic ulcer,gastric muco?sa-associated lymphoid tissue lymphoma and gastric cancer,and using vaccine to control this bacterium has be?come a highlight recently.The neutrophil-activating protein（NAP） is one type of effective candidate molecules of vaccine,the review outlined the status in the research of NAP vaccine against H.pylori mediated by Salmonella ty?phimurium,Lactococcus lactis,Bacillus subtilis and Measles virus.

Helicobacter pylori;neutrophil-activating protein（NAP）;vaccine

R979.5;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0564-04

2016-12-21

國家自然科學(xué)基金（30801052，30671835，30500423，30200239）

李文桂（1967-），男，博士，研究員

李文桂，（E-mail）cqliwengui@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.032