胡俊飛，張華，曲航，王振宇，*，王雪，耿林

（1.哈爾濱工業(yè)大學化工學院，黑龍江哈爾濱150090；2.德之馨（上海）有限公司，上海201206；3.哈爾濱工業(yè)大學材料科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001）

硫酸化黑木耳多糖的輻射防護作用研究

胡俊飛1，張華1，曲航1，王振宇1，*，王雪2，耿林3

（1.哈爾濱工業(yè)大學化工學院，黑龍江哈爾濱150090；2.德之馨（上海）有限公司，上海201206；3.哈爾濱工業(yè)大學材料科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001）

為考察硫酸化黑木耳多糖對60Co-γ射線輻射損傷小鼠的防護作用。以硫酸化黑木耳多糖為受試物，用60Co-γ射線對小鼠進行一次性全身輻射，對小鼠的免疫指標，血清中SOD活力、MDA含量，骨髓DNA含量和骨髓微核率進行測定。結果表明：硫酸化黑木耳多糖對60Co-γ射線輻射損傷小鼠的單核細胞吞噬能力、血清SOD活性有明顯的促進作用，并且能夠增加小鼠免疫器官指數(shù)和骨髓DNA含量，減少血清MDA含量和骨髓微核率，減輕輻射誘導機體的氧化損傷。結論證實，硫酸化黑木耳多糖對60Co-γ射線輻射損傷小鼠具有良好的防護作用。

黑木耳多糖；硫酸化；輻射防護

隨著科學技術的飛速發(fā)展，人類接觸到的輻射源日益增多。電離輻射對人體的危害極大，主要通過直接效應和電離水解產(chǎn)生的間接效應誘導機體氧化損傷[1]。研究表明，電離輻射可以直接與生物大分子作用，破壞核酸、蛋白質和酶等具有生命功能的物質，還可以直接與水作用，使水分子輻射分解產(chǎn)生大量自由基，破壞機體氧化還原平衡狀態(tài)，導致機體抗氧化能力下降，對動物器官、組織以及免疫系統(tǒng)造成嚴重損傷[2]。

近年來已有大量研究表明，食用菌多糖具有明顯的抗輻射[3]作用，可以清除自由基[4]，對造血系統(tǒng)[5]、免疫系統(tǒng)[6]和DNA[7]有較好的保護作用，并且能夠促進損傷的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)恢復功能，經(jīng)過硫酸化修飾后，多糖的分子量大小、空間立體結構以及取代基發(fā)生改變，生物活性也會隨之發(fā)生改變[8]。與輻射防護藥物相比，食用菌多糖具有毒性低、抗輻射效果顯著、體內(nèi)無蓄積、代謝后成為機體營養(yǎng)物質等優(yōu)點，可以作為有潛在價值的輻射防護藥物[9]。本文對硫酸化修飾后的黑木耳多糖的輻射防護進行研究，并與硫酸化修飾前的黑木耳多糖進行對比，旨在為黑木耳多糖抗輻射保健品的研發(fā)和廣泛應用提供提論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

黑木耳：哈爾濱市南極批發(fā)市場；SOD、MDA試劑盒：南京建成生物工程研究所；氯化鈣：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；甲醇：天津市富宇精細化工有限公司；胎牛血清Hyclone公司；瑞氏-姬姆薩復合染液：美國Solarbio公司。

昆明小鼠：雄性，體重（20±2）g，哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2儀器與設備

R200D型電子分析天平：德國賽多利斯公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；721型可見分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司；Model550型酶標儀：日本BIO-RAD公司；CX31型顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3方法

1.3.1多糖制備

原料預處理→料液比1∶80（g/mL）加入水后先膠體磨研磨10min，再進行高壓均質提取（均質壓力30 MPa，均質時間25min）→4 000 r/min離心20min→上清液（粗多糖溶液）→3%H2O2脫色→80%乙醇醇沉→減壓蒸發(fā)（除去殘留的乙醇）→自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h→冷凍干燥→黑木耳多糖（HAAP）。

黑木耳多糖（HAAP）→濃硫酸法修飾（反應時間0.9 h，濃硫酸體積8.0mL，硫酸銨用量130mg）→自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h→濃縮→冷凍干燥→硫酸化黑木耳多糖（SHAAP）。

1.3.2動物模型建立

將雄性昆明種小鼠隨機分為9組，分別為正常對照組（Normal）、輻射模型組（Model）、陽性對照組（Leucogen，12mg/kg·d）、HAAP低劑量組（HAAP-L，50mg/kg·d）、HAAP中劑量組（HAAP-M，100mg/kg·d）、HAAP高劑量組（HAAP-H，200mg/kg·d）、SHAAP低劑量組（SHAAP-L，50 mg/kg·d）、SHAAP中劑量組（SHAAP-M，100mg/kg·d）、SHAAP高劑量組（SHAAPH,200mg/kg·d），正常對照組和輻射模型組灌服生理鹽水，給藥組則灌服相應劑量的藥物，每天1次，每次2.5mL。連續(xù)灌胃14 d后，用60Co-γ射線對除正常對照組外的各組小鼠進行全身性照射，總吸收劑量為6.0Gy，劑量率為1Gy/min，照射后第2天處死動物。

1.3.3免疫指標測定

1.3.3.1免疫器官指數(shù)的測定

將小鼠眼球取血后脫頸處死，立即取出胸腺、脾臟、肝臟和心臟，剔除表面脂肪，用預冷的生理鹽水沖洗表面所沾的血液后，濾紙吸干臟器表面水分，準確稱重，計算器官指數(shù)。

1.3.3.2單核細胞吞噬能力的測定

小鼠經(jīng)輻射處理后24 h，在尾靜脈處注射稀釋3～4倍后的印度墨水。墨汁注射結束后立即計時，分別在2min（t1）和10min（t2）時用毛細管從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中，混勻后用紫外分光光度計于600 nm處測定2 min（A1）和10min（A2）時的吸光度值，0.1%Na2CO3溶液作為空白對照。隨后將小鼠脫頸處死，迅速取出肝臟和脾臟，用預冷的0.9%生理鹽水漂洗，濾紙吸干表面水分，稱重，用吞噬指數(shù)（α）來表示小鼠的單核細胞吞噬能力。

式中：α為吞噬指數(shù)；K為未經(jīng)校正的吞噬指數(shù)；W為小鼠體重，g；M1為小鼠肝重，g；M2為小鼠脾重，g。

1.3.4血清SOD和MDA測定

根據(jù)南京建成試劑盒說明書的有關要求，對小鼠血清SOD活力和MDA含量進行測定。

1.3.5骨髓DNA含量測定

小鼠脫頸處死后取左端股骨，用一次性注射器吸取1mL濃度為5mmol/L的CaCl2溶液，插入股骨一段，沖出股骨中全部骨髓細胞，置于滅菌的10mL離心管中，再加入8mLCaCl2溶液，4℃放置30min，取出后3 000 r/min離心10min，棄上清液，加入5mL濃度為0.2mol/L的HClO4溶液，并于90℃條件下水浴加熱15min，待冷卻至室溫后，4 000 r/min離心10min，吸取上清液，在268 nm波長下測定吸光度值。

式中：OD為268 nm波長下的吸光值；B為骨髓細胞DNA含量，μg。

1.3.6骨髓微核實驗

小鼠經(jīng)脫頸處死后，剪取胸骨，并剔除上面的肌肉，用0.9%生理鹽水清洗干凈后，濾紙擦干，剪去每節(jié)骨骺端，并用小型彎頭鉗子擠出骨髓液，置于預先滴加一滴胎牛血清的載玻片上，充分混勻推片，長度為2 cm～3 cm。骨髓推片經(jīng)晾干后放入染色缸中，加入甲醇溶液將其固定15min，取出晾干。滴加瑞士-姬姆薩A液至整個涂片被覆蓋，染色1min后，滴加瑞士-姬姆薩B液于A液上，用洗耳球吹出微風，使兩種液體充分混合，染色10min后自來水沖洗，晾干并進行鏡檢。在油鏡下選擇適當區(qū)域，觀察骨髓細胞涂片中1 000個嗜多染紅細胞，對含有微核的嗜多染紅細胞進行計數(shù)，并計算每組涂片的微核率。

式中：φ為微核細胞率，‰；α為含微核細胞數(shù)；β為觀察細胞數(shù)。

2結果與分析

2.1免疫指標測定

2.1.1免疫器官指數(shù)的測定結果

胸腺和脾臟是動物體內(nèi)最重要的免疫器官，對輻射損傷高度敏感，心臟和肝臟也是動物體內(nèi)重要的器官，其重量可以反映動物器官發(fā)育程度和功能強弱。HAAP和SHAAP對小鼠器官指數(shù)的影響見表1。

表1 HAAP和SHAAP對小鼠器官指數(shù)的影響Table1 Effectof HAAP and SHAAP on theorgan index ofm ice

由表1可知，輻射組小鼠的器官指數(shù)低于正常組小鼠的器官指數(shù)，其中胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)極顯著低于正常組（P＜0.01），心臟指數(shù)和肝臟指數(shù)顯著低于正常組（P＜0.05）；與輻射組小鼠相比，陽性對照組、HAAP各劑量組以及SHAAP各劑量組器官指數(shù)均有所上升，SHAAP-H組的胸腺指數(shù)、心臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均高于輻射模型組，較其它給藥組效果更佳，SHAAP-M組的脾臟指數(shù)高于其它給藥組。由此可見，SHAAP能夠有效減少輻射誘導的氧化損傷，增強小鼠機體免疫力，起到輻射防護作用。

2.1.2單核細胞吞噬能力測定

單核細胞是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠通過吞噬方式來清除外來病原微生物、壞死細胞、無機顆粒等，發(fā)揮非特異性免疫作用。碳廓清試驗可用來評價非特異性免疫系統(tǒng)的吞噬活性[10]。HAAP和SHAAP對小鼠單核細胞吞噬能力的影響見表2。

表2 HAAP和SHAAP對小鼠單核細胞吞噬能力的影響Table2 Effectof HAAP and SHAAP on phagocytosisability of monocyteofm ice

表2顯示，輻射模型組小鼠的吞噬指數(shù)極顯著低于正常組，表明輻射模型組小鼠的吞噬活性極顯著低于正常組（P＜0.01），輻射已經(jīng)對小鼠免疫系統(tǒng)造成了損傷，使得單核細胞吞噬活性下降。與輻射模型組相比，除利可君組外，其它給藥組的吞噬指數(shù)均顯著增加；與正常組相比，所有給藥組的吞噬指數(shù)均顯著降低，SHAAP-H組差異顯著，其它給藥組差異極顯著。結果表明，SHAAP能夠有效增強小鼠單核細胞吞噬能力，提高小鼠機體免疫活性，減少輻射造成的氧化損傷，但是與正常小鼠相比，機體免疫活性較弱，無法恢復到正常水平。

2.2血清SOD和MDA含量的測定

2.2.1血清SOD活力測定

電離輻射誘導機體產(chǎn)生過量活性氧自由基，引發(fā)自由基鏈式反應，破壞機體抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，SOD是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能夠催化O2-生成H2O2和O2，SOD活力的高低能夠反映機體清除氧自由基的能力。對小鼠血清總SOD活力的研究結果如圖1所示。

與正常組相比，輻射模型組小鼠血清SOD活性顯著下降（P＜0.01）；與輻射模型組相比，各給藥組的SOD活力顯著增強（P＜0.01），利可君組、HAAP以及SHAAP各劑量組可以不同程度地增強小鼠體內(nèi)SOD活力，其中SHAAP-H組小鼠血清SOD高于其它給藥組，結果表明SHAAP能夠通過增強小鼠體內(nèi)SOD活力有效清除對機體有害的超氧陰離子，輻射防護作用最佳。

圖1 HAAP和SHAAP對小鼠血清中SOD活力的影響Fig.1 Effectof HAAP and SHAAP on SOD in serum ofm ice

2.2.2血清MDA含量測定

電離輻射誘導機體產(chǎn)生大量自由基，攻擊生物膜而引發(fā)脂質過氧化，加重輻射損傷。MDA是脂質過氧化的主要產(chǎn)物，其含量高低可以反映機體輻射損傷的程度。對雄性小鼠血清MDA水平的研究結果如圖2所示。

圖2 HAAP及SHAAP對小鼠血清中MDA含量的影響Fig.2 Effectof HAAP and SHAAP on MDA in serum ofm ice

與正常組相比，輻射模型組雄性血清MDA含量顯著增加（P＜0.01）；給藥各劑量組MDA含量均有不同程度的下降，除陽性對照組、HAAP-M組以及SHAAP-L組與正常組相比差異顯著外，其它各給藥組則無明顯差異，HAAP-L、HAAP-H、SHAAP-M和SHAAP-H組對于輻射誘導氧化損傷的防護作用較強，且SHAAP組優(yōu)于HAAP相應劑量組。結果表明，SHAAP均可以有效抑制輻射誘導產(chǎn)生的氧化損傷，降低小鼠機體內(nèi)MDA水平，起到輻射防護作用。

2.3骨髓DNA含量和骨髓微核率測定

2.3.1骨髓DNA含量測定

電離輻射引發(fā)DNA單雙鏈斷裂，使細胞DNA降解，細胞中DNA含量減少[11]。HAAP和SHAAP對小鼠骨髓細胞DNA含量的影響見表3。

表3 HAAP和SHAAP對小鼠骨髓細胞DNA含量的影響Tab le3 Effectof HAAP and SHAAP on bonem arrow DNA contentofm ice

表3顯示，與正常組相比，輻射模型組小鼠骨髓細胞DNA含量明顯下降（P＜0.01）；與輻射組相比，各給藥組小鼠骨髓DNA含量不同程度增加，差異極顯著（P＜0.05）。HAAP和SHAAP各劑量組對小鼠骨髓DNA含量的增加呈濃度依賴關系，隨著給藥濃度的增加，DNA含量升高，并且SHAAP組的輻射防護作用優(yōu)于HAAP組，其中SHAAP-H組小鼠的骨髓DNA含量最高，對DNA的輻射防護作用最強。結果表明，電離輻射造成小鼠DNA損傷，骨髓細胞DNA含量下降；輻射前連續(xù)給藥SHAAP，對電離輻射誘導產(chǎn)生的DNA損傷有抑制作用，即對電離輻射誘導的DNA損傷具有防護作用。

2.3.2骨髓微核率的測定

電離輻射導致基因突變和染色體損傷，使染色體斷裂或者紡錘絲受損傷而產(chǎn)生斷片。細胞有絲分裂時，這些斷片遺留在細胞質中形成微核，微核率能夠反映染色體的損傷程度，因此采用骨髓微核率評價天然活性物質的輻射防護作用[12]。HAAP和SHAAP對小鼠骨髓微核率的影響見表4。

表4顯示，與正常組相比，輻射模型組小鼠骨髓微核率明顯增加（P＜0.01）；與輻射模型組相比，HAAP和SHAAP各劑量組小鼠的骨髓微核率明顯下降，且呈濃度依賴關系，隨著給藥濃度的增加，骨髓微核率降低，高劑量組的效果最佳，說明HAAP和SHAAP均能夠有效抑制輻射誘導產(chǎn)生的染色體損傷，起到輻射防護作用；與HAAP組相比，SHAAP各劑量組的骨髓微核率更低，效果更顯著。實驗結果表明輻射能夠誘導小鼠染色體發(fā)生畸變，使骨髓微核率增加；輻射前連續(xù)給藥SHAAP，可以有效抑制輻射誘導小鼠機體產(chǎn)生的染色體損傷，降低骨髓微核率，起到輻射防護作用。

表4 HAAP和SHAAP對小鼠骨髓微核率的影響Table4 Effectof HAAP and SHAAP on bonemarrow m icronuclei ofm ice

3結論

電離輻射通過直接或間接作用危害機體，使氧化還原平衡系統(tǒng)受到破壞，導致器官組織損傷、DNA降解、染色體損傷、自由基過量、脂質過氧化，結果與文獻報道[1]一致。研究結果顯示，黑木耳多糖和硫酸化黑木耳多糖能夠促進免疫器官指數(shù)以及單核細胞吞噬能力的回升，增強血清SOD活性，增加骨髓DNA含量，并降低血清MDA含量與骨髓微核率，對輻射誘導的氧化損傷有一定的防護作用，且與黑木耳多糖相比，硫酸化黑木耳多糖的輻射防護效果更佳。由實驗結果可知，硫酸化黑木耳多糖主要通過增強機體免疫力、促進抗氧化酶系活性以及防止DNA損傷3個途徑對輻射進行防護，這為黑木耳多糖的深入研究以及黑木耳多糖抗輻射保健品的開發(fā)提供了理論基礎。

[1]賀許良,盧先州,陳枚,等.免疫器官輻射損傷與防護的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2014(5):997-1000

[2]徐德鯤.黃芩苷對輻射損傷小鼠保護作用的研究[D].長春:吉林大學,2007

[3]LiX,Wang Z,Wang L.PolysaccharideofHohenbuehelia serotinaas a defenseagainst damage bywhole-body gamma irradiation ofmice [J].Carbohydrate polymers,2013,94(2):829-835

[4]TadayoniM,Sheikh-Zeinoddin M,Soleimanian-Zad S.Isolation of bioactive polysaccharide from acorn and evaluation of its functional properties[J].International journal of biological macromolecules, 2015,72:179-184

[5]王宏芳,林曉晨,李雪靜,等.松茸多糖對X射線照射小鼠造血功能的保護作用[J].吉林大學學報:醫(yī)學版,2008,34(5):751-754

[6]Zhang L,ZhangW,Wang Q,etal.Purification,antioxidantand immunological activities of polysaccharides from Actinidia Chinensis roots[J].International journal of biologicalmacromolecules,2015, 72:975-983

[7]汪維云.灰樹花多糖的抗輻射作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2003,30(2):210-212

[8]KulickeWM,Lettau A I,Thielking H.Correlation between immunological activity,molar mass,and molecular structure of different (1-＞3)-beta-D-glucans[J].Carbohydrate Research,1997,297(2): 135-143

[9]于純淼,于棟華,國立東,等.食用菌多糖抗輻射損傷作用研究進展[J].食用菌,2015,37(3):1-5

[10]Bhatia S,Rathee P,Sharma K,et al.Immuno-modulation effect of sulphated polysaccharide(porphyran)from Porphyra vietnamensis [J].International journal of biological macromolecules,2013,57: 50-56

[11]Yokoya A,Shikazono N,Fujii K,etal.DNA damage induced by the directeffectof radiation[J].Radiation Physicsand Chemistry,2008, 77(10):1280-1285

[12]Reiter R J,MeltzM L,Herman TS.Melatonin:possiblemechanisms involved in its‘radioprotective’effect[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular MechanismsofMutagenesis,1998,404(1): 187-189

Radioprotection Effects of Sulfated Auricularia auricular Polysaccharides

HU Jun-fei1，ZHANGHua1，QUHang1，WANGZhen-yu1，*，WANGXue2，GENG Lin3
（1.SchoolofChemicalEngineeringand Technology，Harbin Instituteof Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China；2.Symrise（Shanghai）Co.，Ltd.，Shanghai201206，China；3.SchoolofMaterials Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150001，Heilongjiang，China）

In order to investigate the protective effectof sulfated Auricularia auricular polysaccharides on injuredmice induced by60Co-γ.Sulfated Auricularia auricular polysaccharideswere orally administered to groups ofmice.After being exposed wholely to60Co-γ，immune parameters，SOD and MDA in serum，DNA andmicronuclear rates inmarrow were examined.Results showed that sulfated Auricularia auricular polysaccharides could increase the phagocytosis ability ofmonocyte and SOD activity in serum，decrease the formation ofmicronucleiin bonemarrow and MDA in serum and reduce the oxidative damage ofbody induced by radiation.The conclusion of thisexperimentverified the fact thatsulfated Auricularia auricular polysaccharideshas protective effecton damagedmale induced by60Co-γ.

Auriculariaauricular polysaccharides；sulfation；radioprotection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.002

2016-05-06

國家自然科學青年基金（31401483）；黑龍江省博士后基金（LBH-Z14098）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助（hit.nsrif. 2017025）

胡俊飛（1992—），女（漢），研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離、純化及活性。

*通信作者：王振宇（1957—），男，教授，博士生導師。