李　杰，王靜茹，陳　浩，楊　林，祝戎飛

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院過敏反應(yīng)科， 武漢 430030)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(4)：344- 350

由真菌引起的支氣管哮喘等過敏性疾病在臨床上比較常見[1]。交鏈孢霉是一種重要的真菌過敏原，有研究顯示交鏈孢霉在氣傳真菌過敏原中占比較高，為優(yōu)勢真菌[2- 5]。交鏈孢霉可破壞哮喘患者氣道上皮屏障功能[6]，與過敏性哮喘嚴重程度直接相關(guān)[7- 8]。由于在臨床上直接對哮喘患者進行研究會受到患者依從性、取材等多方面的限制，還可能存在著醫(yī)學(xué)倫理問題，很多研究均通過建立哮喘動物模型來實施。小鼠免疫遺傳背景較為清楚，免疫系統(tǒng)認識已較全面深入，加上基因技術(shù)及生物測定技術(shù)的迅猛發(fā)展，小鼠在國內(nèi)外已成為最主要的哮喘動物模型[9- 10]。本研究擬建立交鏈孢霉致敏的Balb/c小鼠過敏性哮喘模型，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

材料與方法

動物與分組

由湖北省疾控中心提供的6周齡SPF級Balb/c雌鼠24只，體重(15±5)g Balb/c雌性小鼠隨機分為2組，每組12只。對照組：以生理鹽水致敏和激發(fā)小鼠；實驗組：以交鏈孢霉提取物致敏和激發(fā)小鼠。

試劑與儀器

交鏈孢霉提取液(濃度100 μg/ml)購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限公司，小鼠白介素(interleukin，IL)- 4和IL- 10、干擾素(interferon，IFN)-γ、總IgE和特異性IgE的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reatcion，PCR)中的Trizol?試劑購自Invitrogen公司，DNase Ⅰ 購自Fermentas公司，小鼠肺功能儀購自SCIREQ公司。

模型建立

哮喘小鼠模型的建立參考文獻[10- 12]進行，首先致敏：各組小鼠在第4、5、6天分別用交鏈孢霉提取液(25 μg/ml)滴鼻致敏，具體步驟如下：小鼠用乙醚麻醉后，移液器吸取50 μl交鏈孢霉提取液或生理鹽水，緩慢滴入小鼠鼻腔中，待全部操作完成后，再次麻醉小鼠，吸取50 μl交鏈孢霉提取液或生理鹽水滴入鼻腔；激發(fā)：第18、19、20天，實驗組再次采用100 μl交鏈孢霉提取液(50 μg/ml)滴鼻激發(fā)，正常對照組采用100 μl 0.9%生理鹽水進行滴鼻。

氣道反應(yīng)性測定

末次激發(fā)48 h內(nèi)，用小鼠肺功能儀有創(chuàng)法測定小鼠的氣道反應(yīng)性。用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉小鼠后，行氣管插管，連接呼吸機，測定小鼠氣道阻力(airway resistance)和氣道順應(yīng)性(airway compliance)的變化。并且經(jīng)儀器加入50 μl乙酰甲膽堿(methacholine)6.25、12.5、25、50 μg/ml，分別觀察氣道反應(yīng)性變化。

支氣管肺泡灌洗液收集及細胞計數(shù)

取血后將小鼠置于仰臥位，固定頭部及四肢，充分暴露氣道，在光線充足情況下，用眼科剪剪開小鼠1/2的氣管，將氣管插管針插入小鼠氣管內(nèi)，固定后緩慢注入1 ml PBS緩沖液進行支氣管肺泡灌洗，然后0.3 ml/次，抽吸3次后，將支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行回收，回收率>80%。BALF 4 000 r/min(離心半徑13.5 cm)，4 ℃離心10 min后，上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中，-20 ℃保存。準備用ELISA檢測BALF中IL- 4、IL- 10以及IFN-γ水平。細胞沉淀則溶于100 μl PBS中重懸，取計數(shù)板計算細胞數(shù)量，圖片固定后做蘇木精-伊紅(hematein eosin，HE)染色，連續(xù)計數(shù)200個細胞并進行分類計算各細胞比例。

血清總IgE和交鏈孢霉特異性IgE檢測

激發(fā)結(jié)束后48 h，麻醉各組小鼠后，將各組小鼠行眼窩取血，收集于干凈的EP管中，置于4 ℃冰箱中待血清析出，4 000 r/min(離心半徑13.5 cm)，4 ℃離心5 min，將血清轉(zhuǎn)移至另一EP管中，ELISA檢測血清總IgE和交鏈孢霉特異性IgE。

肺組織病理切片檢查

打開小鼠胸腔，取出左側(cè)肺組織(一般用左側(cè)肺組織進行固定包埋切片，因為左肺只有一葉，結(jié)構(gòu)很完整)，將肺組織放置于4%的多聚甲醛溶液中，4 ℃過夜后，用梯度酒精溶液脫水、二甲苯溶液透明后用石蠟包埋，使用組織切片機切片，然后采用HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察鼻黏膜與肺組織的炎癥浸潤程度。

肺組織IL- 25 mRNA與IL- 33 mRNA水平測定

取肺組織勻漿，總RNA用TRIzol試劑提取，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，將反應(yīng)體系加到熒光定量PCR反應(yīng)孔中進行PCR擴增。

統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

小鼠行為學(xué)觀察

對照組和實驗組分別有2只小鼠麻醉過程中窒息死亡，另實驗組有3只小鼠在激發(fā)2 d后死亡。進行末次滴鼻激發(fā)后，實驗組小鼠出現(xiàn)不同程度的煩躁不安或安靜少動、口唇紫紺、喘息、行動改變，以出現(xiàn)煩躁嗆咳、抓耳撓鼻、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸、豎毛以及站立不穩(wěn)等癥狀15～30 min后恢復(fù)平靜，而對照組在麻醉蘇醒5～10 min后就恢復(fù)正常。

氣道高反應(yīng)性

實驗組與對照組相比氣道阻力明顯增大，氣道順應(yīng)性明顯降低(表1、2)。

BALF細胞分類計數(shù)

實驗組BALF中細胞總數(shù)和Eos(%)較對照組明顯增加，實驗組 BALF Eos(%)高達 68%(表3)。

BALF中細胞因子

實驗組IL- 4水平[(109.14±42.51)pg/ml]高于對照組[(31.32±12.42)pg/ml](P<0.05)，而 IFN-γ水平[(93.42±51.26)pg/ml]低于對照組[(277.34±24.35)pg/ml](P<0.01)，IL- 10水平實驗組[(359.7±142.9)pg/ml]低于對照組[(627.4±119.1)pg/ml]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表1小鼠氣道阻力
Table1Airway resistance in experimental group and control group mice

組別乙酰甲膽堿(μg/ml)06251252550對照組075±008　　　187±015285±078666±143900±131實驗組087±017　　　296±024a1057±233b1326±579b1640±652b

與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

表2小鼠氣道順應(yīng)性
Table2Airway compliance in experimental group and control group mice

組別乙酰甲膽堿(μg/ml)06251252550對照組0310±0110　　　0190±0067　　　0120±0037　　　0096±0071　　　0061±0013實驗組0280±0160　　　0150±0092a　　　0053±0031b　　　0046±0022b　　　0037±0009b

與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

組別細胞總數(shù)(×105/ml)Eos(%)Mac(%)Lym(%)Neu(%)對照組425±098336±0047932±1325645±1361087±336實驗組2128±458b6833±1780b1569±514b932±087a666±135

BALF：支氣管肺泡灌洗液；Eos：嗜酸性粒細胞；Mac：巨噬細胞；Lym：淋巴細胞；Neu：中性粒細胞;與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

組別IL?4(pg/ml)IFN?γ(pg/ml)IL?10(pg/ml)TIgE(ng/ml)sIgE(ng/ml)IL?33mRNA對照組3132±1242　27734±2435　　62741±11911　　18501±67252341±874　　066±031實驗組　　10914±4251a9342±5126b　　35974±14293　　88394±12233a　　6576±1556a　　221±058b

IL- 4：白介素- 4；IFN-γ：γ干擾素；IL- 10：白介素- 10；TIgE：總免疫球蛋白E；sIgE：特異性免疫球蛋白E;與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

血清中總IgE和特異性IgE水平

實驗組血清總IgE和特異性IgE水平[分別為(883.94±122.33)ng/ml和(65.76±15.56)ng/ml]均明顯高于對照組[分別為(185.01±67.25)ng/ml和(23.41±8.74)ng/ml](P<0.01)(表4)。

肺組織中IL- 25 mRNA與IL- 33 mRNA表達水平

IL- 25 mRNA兩組均表達過低，未測出；IL- 33 mRNA表達水平實驗組(2.21±0.58)高于對照組(0.66±0.31)(表4)。

肺組織病理學(xué)變化

HE染色光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變,與對照組(圖1，3，5)正常小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相比，實驗組小鼠肺小血管壁增厚，黏膜下炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞增多(圖2)；管腔黏膜增厚，管腔變窄，黏液滲出增多，黏液栓形成，周圍炎癥細胞浸潤(圖4)；肺泡間隔增厚，結(jié)構(gòu)欠完整，大量炎癥細胞浸潤滲出(圖6)。

討　　論

真菌尤其是交鏈孢霉對哮喘的影響巨大。Lyons等[2]調(diào)查914例哮喘兒童發(fā)現(xiàn)14%的兒童對真菌過敏，真菌過敏的哮喘兒童中又有46%對交鏈孢霉過敏。一項4 962例呼吸系統(tǒng)疾病患者的研究顯示，19%的過敏患者對至少一種真菌提取物過敏，而這些真菌過敏患者中又有60%對交鏈孢霉過敏[3]。我國廣州交鏈孢霉是主要氣傳真菌之一[4]。武漢地區(qū)氣傳真菌調(diào)查顯示交鏈孢霉菌占13.87%，為優(yōu)勢真菌。

圖1　對照組小血管HE染色Fig 1　Control group small vessel(HE)

圖3　對照組細支氣管HE染色Fig 3　Control group bronchiole(HE)

圖5　對照組肺泡HE染色Fig 5　Control group alveolar(HE)

圖2　實驗組小血管HE染色Fig 2　Experience group small vessel(HE)

圖4　實驗組細支氣管HE染色Fig 4　Experience group bronchiole(HE)

圖6　實驗組肺泡HE染色Fig 6　Experience group alveolar(HE)

有7.14%的哮喘患者和11.71%的過敏性鼻炎并發(fā)哮喘患者對交鏈孢霉提取物呈現(xiàn)皮膚試驗陽性反應(yīng)[5]。

動物模型是研究哮喘發(fā)病機制和新的治療方法的重要工具。用作哮喘模型的實驗動物先后有狗、兔、羊、豚鼠、大鼠等，直到最近小鼠以其便于飼養(yǎng)，繁殖能力強等優(yōu)點成為模型制作最佳的備選動物而普遍使用，其中又以SPF級6～8周齡Balb/c小鼠最為多見，因Balb/c小鼠易產(chǎn)生針對卵白蛋白(ovalbumin，OVA)和花粉的高滴度IgE和氣道高反應(yīng)性，其實驗結(jié)果相對穩(wěn)定[10]。小鼠免疫遺傳背景較為清楚，免疫系統(tǒng)認識已較全面深入，加上基因技術(shù)及生物測定技術(shù)的迅猛發(fā)展，小鼠在國內(nèi)外已成為最主要的哮喘動物模型[10]。

盡管交鏈孢霉是重要的吸入性過敏原之一，但目前國內(nèi)外對交鏈孢霉誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型研究甚少[11]，僅有極少數(shù)文章提及使用交鏈孢霉建立哮喘模型方法，且多是沿用OVA的致敏方法進行研究[13]，但OVA并不是人體接觸誘發(fā)哮喘的自然致敏原，不能完全模擬人體接觸天然過敏原后的反應(yīng)。有研究顯示致敏過程中單獨經(jīng)鼻腔給予OVA不能誘發(fā)氣道高反應(yīng)性及肺部嗜酸性粒細胞浸潤、Th2型細胞因子增加、氣道黏液高分泌等哮喘特征[14]。然而作為天然變應(yīng)原的交鏈孢霉是直接通過呼吸道途徑進入人體致敏的，這點與OVA不同。本實驗選擇經(jīng)鼻腔途徑致敏小鼠，這也更符合哮喘發(fā)病的自然過程。而且有研究顯示，相對于霧化吸入的方式，經(jīng)鼻滴入方式可以引起肺部更加明顯的炎癥浸潤及細胞因子表達，為哮喘研究提供更好的選擇[15]。本實驗選取交鏈孢霉提取液滴鼻誘導(dǎo)建立小鼠過敏性哮喘模型，操作簡單，控制性高，可重復(fù)性強，能模擬臨床上哮喘發(fā)展和過敏性哮喘的發(fā)作過程，其缺點是麻醉過程中小鼠容易窒息致死。

驗證小鼠哮喘模型是否建立成功往往采用復(fù)合指標。小鼠過敏性哮喘的實質(zhì)是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，其IgE水平是變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)生的重要決定因素。小鼠變態(tài)反應(yīng)性炎癥的重要特征指標是Th1細胞與Th2細胞比例失衡，相應(yīng)的IL- 4等Th2型細胞因子增高，IFN-γ等Th1型細胞因子降低。此外小鼠出現(xiàn)呼吸困難的癥狀，肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞增加，血清IgE升高，肺組織病理學(xué)檢查也出現(xiàn)炎癥細胞浸潤等也作為小鼠哮喘模型成功的指標[10- 12]。本研究實驗組小鼠相對于對照組小鼠，在行為學(xué)上有哮喘的癥狀出現(xiàn)，尤其是抓耳撓鼻，點頭呼吸，呼吸加快明顯，持續(xù)時間久，符合哮喘的表現(xiàn)；氣道阻力增加，氣道順應(yīng)性降低符合哮喘氣道反應(yīng)性特征；肺泡灌洗液中總細胞和嗜酸性粒細胞比例增加符合哮喘的變化；血清總IgE和特異性IgE水平明顯升高，符合哮喘發(fā)生的基本機制；BALF中IL- 4水平明顯升高，IFN-γ水平明顯下降，亦符合哮喘發(fā)病機制中Th1/Th2失衡且Th2型細胞因子占優(yōu)勢的論斷；肺組織病理學(xué)檢查表現(xiàn)為支氣管和血管黏膜下和周圍肺組織有明顯的炎癥細胞浸潤，管腔內(nèi)黏液分泌增多，符合哮喘的病理變化。最近研究表明，IL- 25和IL- 33分別不同程度地影響了氣道的功能和重塑[16- 19]。本實驗還對肺組織的IL- 25和IL- 33 mRNA表達水平進行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組IL- 25 mRNA均表達過低，而IL- 33 mRNA的升高，可能提示IL- 33參與過敏性哮喘的發(fā)生。研究結(jié)果還證實了交鏈孢霉可單獨誘發(fā)過敏性哮喘的發(fā)生，提示其對人群哮喘的發(fā)生可能具有重要的影響。上述變化提示使用交鏈孢霉滴鼻激發(fā)致敏的Balb/c小鼠哮喘動物模型建立成功。但本實驗亦存在不足之處：小鼠肺功能的檢測采用的是國際上通用的有創(chuàng)檢測方法[20]，有創(chuàng)小鼠氣道反應(yīng)性測定法需通過氣管插管和機械通氣來完成，能準確地反映氣道阻力變化[21]，但無法對同一只小鼠進行重復(fù)檢測來比較交鏈孢霉激發(fā)前后肺功能的改變，只能通過比較實驗組和對照組過敏原激發(fā)后氣道阻力的差異判斷小鼠的氣道反應(yīng)性。檢測小鼠氣道反應(yīng)性的其他方法包括離體氣道平滑肌收縮力測定法和無創(chuàng)的整體體積描記法，由于離體方法不能反映由氣道內(nèi)黏液分泌、黏膜水腫以及小氣道病變所引起的肺通氣功能障礙，而無創(chuàng)的整體體積描記法不能直接反映氣道阻力[21]，因此本研究未采用后兩種方法。

綜上所述，采用交鏈孢霉滴鼻致敏、激發(fā)的方法能夠成功誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生過敏性哮喘反應(yīng)的模型，為后續(xù)交鏈孢霉誘發(fā)的哮喘研究打下了基礎(chǔ)。

[1]Prester L. Indoor exposure to mould allergens[J]. Arh Hig Rada Toksikol, 2011, 62: 371- 380.

[2]Lyons TW, Wakefield DB, Cloutier MM. Mold andAlternariaskin test reactivity and asthma in children in Connecticut[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2011, 106: 301- 307.

[3]Mari A, Schneider P, Wally V, et al. Sensitization to fungi: epidemiology, comparative skin test, and IgE reactivity of fungal extracts[J]. Clin Exp Allergy, 2003,33: 1429- 1438.

[4]張華，鄭卓. 廣州市氣傳真菌散布規(guī)律與氣候的關(guān)系[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2006, 27: 596- 600.

[5]祝戎飛. 武漢市氣傳花粉和真菌監(jiān)測及臨床意義[D]. 武漢: 華中科技大學(xué)，2011：5- 98.

[6]Leino MS, Loxham M, Blume C, et al. Barrier disrupting effects ofAlternariaalternate extract on bronchial epithelium from asthmatic donors[J]. PLoS One, 2013, 8: e72178.

[7]Salo PM, Arbes SJ Jr., Sever M, et al. Exposure to Altetnaria alternate in US homes is associated with asthma symptoms[J]. J Allergy Clin Immunol, 2006, 118: 892- 898.

[8]Katotomichelakis M, Anastassakis K, Gouveris H, et al. Clinical significance ofAlternariaalternate sensitization in patients with allergic rhinitis[J]. Am J Otolaryngol, 2012, 33: 232- 238.

[9]Lloyd CM. Building better mouse models of asthma[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2007, 7: 231- 236.

[10] 朱艷芬, 宋澤慶. 小鼠支氣管哮喘模型的研究現(xiàn)狀[J].中華哮喘雜志, 2009, 3: 311- 314.

[11] 杜軍, 郭宏偉. 哮喘小鼠模型研究現(xiàn)狀分析[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2011, s1: 1209- 1211.

[12] Jutel M, Jaeger L, Suck R, et al. Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens[J]. J Allergy Clin Immunol, 2005, 116: 608- 613.

[13] 譚杰軍. 哮喘動物模型建立的思考與體會[J]. 中國中醫(yī)急癥, 2016, 25: 816- 817.

[14] Zhang Y, Lamm WJ, Albert RK, et al. Influence of the route of allergen administration and genetic background on the murine allergic pulmonary response[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155: 661- 669.

[15] 程勝. 滴鼻和霧化兩種不同激發(fā)方式對小鼠支氣管哮喘模型氣道炎癥的影響[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014, 2: 121- 124.

[16] Barlow JL, Peel S, Fox J, et al. IL- 33 is more potent than IL- 25 in provoking IL- 13-producing nuocytes (type 2 innate lymphoid cells) and airway contraction[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013, 132: 933- 941.

[17] Kurokawa M, Matsukura S, Kawaguchi M, et al. Expression and effects of IL- 33 and ST2 in allergic bronchial asthma: IL- 33 induces eotaxin production in lung fibroblasts[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2011, 155: 12- 20.

[18] Liew FY, Pitman NI, McInnes IB. Disease-associated functions of IL- 33: the new kid in the IL- 1 family[J]. Nat Rev Immunol, 2010, 10: 103- 110.

[19] Nabe T. Interleukin (IL)- 33: new therapeutic target for atopic diseases[J]. J Pharmacol Sci, 2014, 126: 85- 91.

[20] Kim HK, Lee CH, Kim JM, et al. Biphasic late airway hyperresponsiveness in a murine model of asthma[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2013, 160: 173- 183.

[21] 何勝東.小鼠哮喘模型氣道反應(yīng)性檢測方法的建立[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2006, 27: 1659- 1661.