李 優(yōu), 徐敦明, 伊雄海*, 盛永剛, 時逸吟, 趙善貞, 鄧曉軍

(1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135; 2. 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局, 福建 廈門 361026)

研究論文

固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中二甲基黃

李 優(yōu)1, 徐敦明2, 伊雄海1*, 盛永剛1, 時逸吟1, 趙善貞1, 鄧曉軍1

(1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135; 2. 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局, 福建 廈門 361026)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定食品中二甲基黃(DMY)的分析方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取,二甲基黃專用固相萃取小柱(ProElut DMY SPE)凈化,XDB-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm, 1.8 μm)分離,并以5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-乙腈(含0.1%(v/v)甲酸)為流動相,梯度洗脫,電噴霧正離子模式(ESI+)電離,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測,內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，DMY在0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。方法的檢出限(LOD,S/N>3)和定量限(LOQ,S/N>10)分別為2 μg/kg和10 μg/kg。不同食品基質(zhì)中,DMY在10、20和100 μg/kg的添加水平下的平均加標(biāo)回收率為93.3%～98.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.9%(n=6)。該方法有效補(bǔ)償了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測過程中的離子化抑制效應(yīng),靈敏度和準(zhǔn)確度高,適用于腐乳、辣椒醬、禽蛋、豆干、糖果和火腿中DMY的測定。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;固相萃取;內(nèi)標(biāo)法;基質(zhì)效應(yīng);二甲基黃;食品

二甲基黃(dimethyl yellow, DMY)又稱蘇丹黃、奶油黃,是脂溶性偶氮染料,通常作為工業(yè)染劑添加于汽油、蠟油、塑料等物質(zhì)中,是諸多國家公認(rèn)的禁用食品添加劑[1-5]。該物質(zhì)被人體攝入后,在代謝過程中可與蛋白質(zhì)、DNA等結(jié)合,會對皮膚、肝臟和膀胱產(chǎn)生毒性,大量動物實(shí)驗(yàn)表明,長期低劑量攝入DMY可誘發(fā)肝癌、膀胱癌和肺癌[6]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)早在1987年就已將DMY列為人體可能的致癌物[7]。2014～2015年,我國香港、臺灣地區(qū)多次曝出不法商販為改善食品色澤在腐乳、豆干中大量非法添加DMY的事件,對人們的食品安全造成了嚴(yán)重威脅。因此，建立多種食品基質(zhì)中DMY的檢測方法,對保障食品安全、進(jìn)出口食品質(zhì)量具有重要意義。 目前國內(nèi)外報道的檢測食品中DMY的方法主要有LC法[8-11]、LC-MS/MS法[12-17]、GC-MS法[18]和GC-MS/MS法[19]。其中,LC-MS/MS法因其技術(shù)成熟、靈敏度和準(zhǔn)確性高,已被廣泛應(yīng)用于食品中禁用色素的檢測。目前報道的LC-MS/MS法測定DMY時多采用外標(biāo)法定量,在質(zhì)譜分析過程中也普遍存在基質(zhì)干擾、定量準(zhǔn)確度低、僅適用于1～2種食品基質(zhì)的問題。范素芳等[13]采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液消除基質(zhì)效應(yīng),但適用的基質(zhì)類型單一、操作繁瑣、試劑消耗量大,不能滿足日常大規(guī)模、多類型樣品的檢測需求。同位素內(nèi)標(biāo)法操作簡單,不僅能一次性消除多種食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng),還能校正樣品前處理過程中目標(biāo)化合物損失帶來的誤差,提高定量準(zhǔn)確性,現(xiàn)已被廣泛用于質(zhì)譜分析,但未見采用該定量方法測定食品中DMY的報道。

本文采用DMY專用SPE柱,建立了LC-MS/MS測定腐乳、辣椒醬、禽蛋、豆干、糖果和火腿中DMY含量的分析方法。同時對測定過程中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察,通過添加同位素內(nèi)標(biāo)有效補(bǔ)償了檢測過程中所有食品基質(zhì)的離子化抑制效應(yīng),提高了定量準(zhǔn)確度,同時擴(kuò)大了方法的適用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司); Centrifuge 5810R離心機(jī)(德國Eppendorf公司); KMC-1300V觸式振蕩器(韓國Vision公司);固相萃取裝置(美國Superlco公司); ProElut DMY SPE柱(300 mg/3 mL,北京迪馬科技有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

DMY標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)購自德國Dr. Ehrensorfer公司;D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)購自加拿大CDN公司;甲醇、乙腈和乙酸乙酯(色譜純)均購自德國CNW公司;甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司;氯化鈉、氨水、無水乙酸銨、鹽酸(分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

分別準(zhǔn)確稱取適量DMY和D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃避光保存;移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液,根據(jù)需要用乙腈逐級稀釋，并配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

試樣：豆干、熟禽蛋和火腿用粉碎機(jī)搗碎;糖果置于研缽中研細(xì);腐乳和辣椒醬直接使用。稱取1 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入2 mL水、50 μL 1 mg/L的D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于25 ℃水浴超聲10 min后,加入1 g氯化鈉和10 mL乙酸乙酯,渦旋混合5 min,以4 000 r/min離心5 min,吸取2.5 mL上清液至15 mL離心管中,待凈化。

用3 mL乙酸乙酯活化ProElut DMY SPE柱;將待凈化液轉(zhuǎn)移至DMY SPE柱中,用3 mL乙酸乙酯以1 mL/min的流速淋洗,棄去淋洗液,于負(fù)壓下抽干SPE小柱,用5 mL氨水-甲醇(1∶9, v/v)以1 mL/min的流速洗脫,收集洗脫液于15 mL離心管中,于40 ℃下氮吹至干,加入2 mL乙腈超聲2 min,振蕩2 min,過0.22 μm濾膜,供LC-MS/MS測定。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜柱:Agilent XDB-C18 (50 mm×4.6 mm, 1.8 μm);流動相A:含0.1%(v/v)甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液,流動相B:含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 20%B; 4.0～14.0 min, 80%B; 14.0～16.5 min, 20%B。

離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。DMY和D5-DMY的保留時間、定性離子、定量離子及碎裂電壓、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 DMY和D5-DMY的保留時間、母離子、子離子及其他質(zhì)譜參數(shù)

CE: collision energy; DMY: dimethyl yellow; D5-DMY: D5-dimethyl yellow; * Quantitative ion.

圖 2 DMY和D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)在MRM模式下的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of DMY and D5-DMY standard solutions (10 μg/L) under MRM modea. quantitative ion of DMY; b. qualitative ion of DMY; c. quantitative ion of D5-DMY.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取1 mL 1 mg/L的DMY和D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)工作液,在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,得到DMY母離子[M+H]+(m/z225.5)(見圖1a)和D5-DMY母離子[M+H]+(m/z230.5)(見圖1b)。對上述母離子施加不同的碰撞能量,對產(chǎn)生的子離子進(jìn)行全掃描,得到相對豐度較高的DMY子離子[C6H5]+(m/z76.9)、[C8H10N]+(m/z120.0)、[C7H7N3]+(m/z132.8)(見圖1c)和D5-DMY子離子[C6D5]+(m/z82.0)、[C8H10N]+(m/z120.0)、[C7H7N3]+(m/z132.8)(見圖1d)。實(shí)驗(yàn)中分別選擇基質(zhì)干擾少、選擇性高的兩對子離子作為定量、定性離子,再以MRM模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù),優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下,對質(zhì)量濃度為10 μg/L的DMY及D5-DMY標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析,其MRM色譜圖見圖2。

圖 1 DMY和D5-DMY的母離子和子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig. 1 Full scan MS spectra of precursor ions and precursor ions of DMY and D5-DMY a. precursor ion of DMY; b. precursor ion of D5-DMY; c. product ion of DMY; d. product ion of D5-DMY.

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

DMY為脂溶性色素,根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性和化學(xué)性質(zhì),分別用乙腈、丙酮、乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)、乙酸乙酯和正己烷對腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿進(jìn)行提取,隨后將提取液吹干,用乙腈溶解后直接進(jìn)行儀器分析,考察不同的提取溶劑對提取效率的影響(見圖3)。結(jié)果表明,采用乙腈和丙酮時,目標(biāo)分析物的回收率較低,回收率僅為30%～50%;采用正己烷提取時,回收率最高,但提取液混濁、油脂雜質(zhì)多,對凈化過程造成困難;采用乙酸乙酯提取時,回收率較好,且雜質(zhì)含量相對較少。因此最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖 3 不同提取溶劑對DMY回收率的影響Fig. 3 Effect of the different extraction solvents on the recoveries of DMY

2.2.2 凈化方法的選擇

圖 4 不同凈化方法對DMY回收率的影響Fig. 4 Effect of the different clean up methods on the recoveries of DMY WCX: weak cation exchange; SCX: strong cation exchange; Alumina-N: neutral alumina; GPC: gel permeation chromatography.

目前報道的凈化DMY的方法主要有固相萃取法[11,20-22]、QuEChERS法[13,14]和凝膠滲透色譜法(GPC)[9,12,17,18]。其中,用于凈化DMY的固相萃取小柱有弱陽離子交換柱(WCX)、中性氧化鋁柱(alumina-N)、強(qiáng)陽離子交換柱(SCX)和DMY專用柱(ProElut DMY SPE)。分別采用上述凈化方法對加標(biāo)10 μg/kg DMY的腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿的乙酸乙酯提取液進(jìn)行凈化,考察不同凈化方法對DMY回收率的影響(見圖4)。結(jié)果表明,采用WCX柱時,DMY的保留較弱,回收率小于10%;采用中性氧化鋁柱和QuEChERS法時,對含油量高的樣品(辣椒醬)的凈化效果較差,凈化液顏色較深,回收率較低;采用SCX柱時,凈化效果一般、樣品回收率較低;采用GPC法時,DMY的凈化效果最好,回收率最高,但是試劑消耗量大、凈化時間長，對人體危害大;采用DMY專用柱時,DMY的回收率和采用GPC法時接近,但試劑消耗少、凈化時間短、前處理效率高。綜合考慮凈化效果、分析效率和分析成本,本方法選擇ProElut DMY SPE柱對DMY進(jìn)行凈化。

2.2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

研究比較了不同pH值的上樣液和淋洗液對DMY吸附效率的影響(見圖5)。結(jié)果表明,上樣液和淋洗液的pH值在2.0～7.0時,DMY的回收率無明顯波動,且回收率均>80%。因此,本研究不調(diào)節(jié)上樣液和淋洗液的pH值,直接采用乙酸乙酯提取液上樣,并用乙酸乙酯淋洗。

圖 5 上樣液和淋洗液的pH值對DMY回收率的影響Fig. 5 Effect of pH values of sample solution and rinse solution on the recoveries of DMY

吸取1 mg/L 的DMY標(biāo)準(zhǔn)工作液溶于乙酸乙酯中,配制成3 mL上樣液,先用3 mL乙酸乙酯淋洗,再用10 mL氨水-甲醇(1∶9, v/v)洗脫,每1 mL收集一次洗脫液,測定DMY的回收率,其洗脫曲線見圖6?？梢钥闯?當(dāng)洗脫液用量超過4 mL時,DMY的回收率為0,說明洗脫液中已沒有DMY。為保證洗脫完全,本實(shí)驗(yàn)選用5 mL洗脫液進(jìn)行洗脫。

圖 6 采用氨水-甲醇(1∶ 9, v/v)洗脫時DMY的洗脫曲線Fig. 6 Elution curve of DMY with the eluent of ammonia solution-methanol (1∶ 9, v/v)

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)在LC-MS/MS分析中普遍存在,且隨儀器、試劑和樣品基質(zhì)的不同而表現(xiàn)不同,對ESI源具有明顯的離子化抑制作用,影響檢測靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度。目前,主要通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件、添加同位素內(nèi)標(biāo)、優(yōu)化色譜分離條件、修正質(zhì)譜分析參數(shù)等方法來消除基質(zhì)效應(yīng)[23-25]。

本實(shí)驗(yàn)對DMY在腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。用上述試樣按1.2節(jié)制備空白樣品溶液,并向空白樣品溶液添加DMY,配制質(zhì)量濃度為10、20和100 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時配制相同質(zhì)量濃度的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,并按下列公式計(jì)算ME[23]:

其中,A、B、C分別為試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)樣品中DMY的含量(μg/L)。當(dāng)ME大于100%時,表明存在離子化增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)ME小于100%時,表明存在離子化抑制效應(yīng)。具體計(jì)算結(jié)果見表2。

另外,分別以外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對添加含量為10、20和100 μg/kg DMY的腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿進(jìn)行定量分析,并對結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

以配備ESI源的LC-MS/MS法測定腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿中的DMY,離子化抑制效應(yīng)明顯存在,并且在不同食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)差異較大。若以試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量,回收率僅為51.8%～67.3%,無法滿足檢測要求;采用D5-DMY作為同位素內(nèi)標(biāo)對定量結(jié)果進(jìn)行校正,能有效補(bǔ)償離子化抑制效應(yīng),改善回收率(93.3%～98.9%),提高定量準(zhǔn)確性。該法與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法相比,操作簡便,因此選為本文的定量方法。

2.3.2 檢出限和線性關(guān)系

在空白腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物,以S/N>3和S/N>10確定DMY的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為2 μg/kg和10 μg/kg。

表 2 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量時DMY的基質(zhì)效應(yīng)(ME)和回收率(n=6)

對DMY質(zhì)量濃度分別為0、1.25、2.5、6.25、12.5、25和50 μg/L、D5-DMY質(zhì)量濃度為6.25 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定,以DMY定量離子和D5-DMY定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)、對應(yīng)質(zhì)量濃度的比值(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=1.09X+0.02,DMY在0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)>0.999。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

在腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿基質(zhì)中添加10、20和100 μg/kg的DMY標(biāo)準(zhǔn)品,按1.2節(jié)進(jìn)行前處理,進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)(n=6)。結(jié)果表明,方法的平均加標(biāo)回收率為93.3%～98.9%, RSD為1.6%～3.9%(見表3)?？瞻赘闃悠泛吞砑?0 μg/kg DMY腐乳樣品的選擇性離子色譜圖分別見圖7和圖8。結(jié)果顯示,腐乳樣品中(見圖8)DMY的色譜峰峰形良好、基質(zhì)干擾少。說明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、精密度高,符合DMY的檢測要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測

采用本文建立的方法對當(dāng)?shù)爻匈彽玫?0份腐乳、辣椒醬、豆干、禽蛋、糖果和火腿樣品進(jìn)行測定,結(jié)果均未測出DMY。

表 3 食品中DMY的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖 7 空白腐乳樣品中DMY和D5-DMY(50 μg/kg)的選擇性離子色譜圖Fig. 7 Selected ion chromatograms of DMY and D5-DMY (50 μg/kg) in a blank sufu samplea. quantitative ion of DMY; b. qualitative ion of DMY; c quantitative ion of D5-DMY.

圖 8 加標(biāo)腐乳樣品中DMY(10 μg/kg)和D5-DMY(50 μg/kg)的選擇性離子色譜圖Fig. 8 Selected ion chromatograms of DMY (10 μg/kg) and D5-DMY (50 μg/kg) spiked in a sufu samplea. quantitative ion of DMY; b. qualitative ion of DMY; c. quantitative ion of D5-DMY.

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定腐乳、辣椒醬、禽蛋、豆干、糖果和火腿中二甲基黃含量的分析方法。采用二甲基黃專用固相萃取小柱進(jìn)行凈化,對多種食品基質(zhì)的凈化效果良好。通過同位素內(nèi)標(biāo)法定量可同時補(bǔ)償所有食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng),有效提高定量的準(zhǔn)確性,擴(kuò)大方法的適用范圍。方法的檢出限、回收率、精密度等均滿足我國對食品中二甲基黃含量的檢測要求,可作為分析確證的儲備方法。

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Determination of dimethyl yellow in foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction

LI You1, XU Dunming2, YI Xionghai1*, SHENG Yonggang1, SHI Yiyin1,ZHAO Shanzhen1, DENG Xiaojun1

(1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China;2.XiamenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Xiamen361026,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was established for the determination of dimethyl yellow (DMY) in foods. The samples spiked with D5-dimethyl yellow (D5-DMY) as the internal standard were extracted with ethyl acetate, cleaned up by a ProElut DMY SPE column. The separation was performed on an XDB-C18 column (50 mm×4.6 mm, 1.8 μm) with the mobile phases of 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid and acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid. The identification and quantitation of DMY was performed by MS/MS in positive electrospray ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring (MRM) mode. The quantitative analysis was carried out by internal standard method. A good linear relationship, with the correlation coefficient (r2) greater than 0.999, was found in the mass concentration range of 0-50 μg/L. The limit of detection (LOD,S/N>3) and the limit of quantitation (LOQ,S/N>10) were 2 μg/kg and 10 μg/kg, respectively. The recoveries of DMY in foods spiked with 10, 20 and 100 μg/kg varied from 93.3% to 98.9%, and the relative standard deviations (RSDs) were between 1.6% and 3.9% (n=6). The method can effectively correct the ionization suppression, and it is sensitive, accurate and suitable for the monitoring of DMY in sufu, chili sauce, egg, dried bean curd, candy and ham.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); solid phase extraction (SPE); internal standard method; matrix effect (ME); dimethyl yellow (DMY); foods

10.3724/SP.J.1123.2016.10042

2016-10-19

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2013YQ15055705);上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對專項(xiàng)(14TBT006,15TBT004,15TBT005);上海市科委技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)(15DZ0503201);長三角科技合作項(xiàng)目(15395810100).

Foundation item: National Key Scientific Instrument Development Project (No. 2013YQ15055705); Shanghai Technical Barrier Trade Item (Nos. 14TBT006, 15TBT004, 15TBT005); Technical Standard Item of Shanghai Science and Technology Commission (No. 15DZ0503201); Yangtze River Delta Science and Technology Cooperation Project (No. 15395810100).

O658

A

1000-8713(2017)04-0398-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)38620517,E-mail:yixh@shciq.gov.cn.