孫 宏 年， 畢 昌 昊， 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308 )

紫色桿菌素在谷氨酸棒狀桿菌中異源表達(dá)

孫 宏 年1， 畢 昌 昊2， 張 春 枝1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308 )

驗(yàn)證了以產(chǎn)L-色氨酸的谷氨酸棒狀桿菌為底盤細(xì)胞異源表達(dá)紫色桿菌素的可行性。從天然產(chǎn)紫色桿菌素的Janthinobacteriumlividum獲得了相關(guān)生物合成途徑的結(jié)構(gòu)基因vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，并且在每個(gè)基因前面添加谷氨酸棒狀桿菌的保守SD序列元件，與穿梭表達(dá)型質(zhì)粒pEC-XK99E通過(guò)Golden-gate DNA裝配方法構(gòu)建，轉(zhuǎn)化到能夠產(chǎn)L-色氨酸CorynebacteriumglutamicumCICC 20192，實(shí)現(xiàn)了紫色桿菌素在谷氨酸棒狀桿菌中的異源表達(dá)。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，最終90 h的搖瓶分批發(fā)酵獲得了(1 243±207) mg/L紫色桿菌素，結(jié)果表明，谷氨酸棒狀桿菌是異源表達(dá)紫色桿菌素的合適宿主。

紫色桿菌素；谷氨酸棒狀桿菌；異源表達(dá)

0 引 言

紫色桿菌素(violacein)和脫氧紫色桿菌素(deoxyviolacein)是微生物生成的具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗致病菌、抗病毒、抗氧化等活性[1-2]。紫色桿菌素是以L-色氨酸為前體物質(zhì)，經(jīng)過(guò)在同一個(gè)操縱子上編碼的酶按照vioA→vioB→vioE→vioD→vioC的酶促反應(yīng)順序催化生成，其中在沒(méi)有酶vioD催化的情況下會(huì)生成脫氧紫色桿菌素[3]。目前發(fā)現(xiàn)了很多革蘭氏陰性桿菌能夠天然產(chǎn)生紫色桿菌素，尤其對(duì)Chromobacteriumviolaceum、Janthino-bacteriumlividum和Duganellasp.B2的研究較為深入[4-6]，但是受限于其較低的產(chǎn)物生成速率、前體物質(zhì)不足以及致病性等因素?zé)o法進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著代謝工程和系統(tǒng)微生物學(xué)的發(fā)展，研究者開(kāi)始對(duì)E.coli進(jìn)行遺傳改造，提供更充足的L-色氨酸前體來(lái)生產(chǎn)紫色桿菌素[7]。谷氨酸棒狀桿菌一般認(rèn)為是安全的(GRAS)革蘭氏陽(yáng)性菌，并且已經(jīng)多年來(lái)作為工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，本研究首次探索以其為底盤細(xì)胞，來(lái)異源生產(chǎn)紫色桿菌素，為紫色桿菌素的未來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試 劑

硫酸卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，美國(guó)Axygen公司；DNA 回收試劑盒，美國(guó)Biomiga公司；Prime STAR HS DNA聚合酶，大連寶生物工程公司；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker、Trans2K Plus DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ、DpnⅠ、EcoR V， T4 DNA連接酶，New England Biolabs公司。

1.1.2 儀 器

PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Shimadzu。

1.1.3 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物見(jiàn)表1。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，121 ℃，15 min；

BHIS培養(yǎng)基(g/L)：牛腦心浸粉37，D-山梨醇91，分別滅菌，使用前混合，121 ℃，15 min；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，酵母浸粉10，玉米漿30，硫酸銨4，七水硫酸鎂0.25，磷酸二氫鉀1.0，磷酸氫二鉀1.0，七水硫酸亞鐵0.01，硫酸錳0.01，pH 7.2，115 ℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，玉米漿50，硫酸銨10，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1.0，磷酸氫二鉀1.0，七水硫酸亞鐵0.01，硫酸錳0.01，苯丙氨酸0.03，酪氨酸0.03，碳酸鈣10，pH 7.2，115 ℃，20 min。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒和引物

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

1.2.2.1 基因組的提取

在LB培養(yǎng)基中，對(duì)Janthinobacteriumlividum30 ℃培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體，使用基因組提取試劑盒提取基因組，-20 ℃冷凍備用。

1.2.2.2 目的基因的擴(kuò)增

谷氨酸棒狀桿菌的保守SD序列為GAAAGGAGGTTT[8]，所以在表達(dá)外源基因時(shí)，在每個(gè)功能基因前面加入宿主菌的保守SD序列增強(qiáng)外源蛋白的表達(dá)量以提高產(chǎn)量。以Janthinobacteriumlividum基因組為模板，分別以vioA-F/vioA-R、vioB-F/vioB-R、vioC-F/vioC-R、vioD-F/vioD-R、vioE-F/vioE-R作為前后引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以pEC-XK99E為模板，pEC-F/pEC-R為前后引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，DpnⅠ消化過(guò)夜后對(duì)目的片度進(jìn)行DNA凝膠回收。

1.2.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化子的篩選

采用Golden-gate DNA裝配方法[9]構(gòu)建pEC-vio，將Golden-gate反應(yīng)液化學(xué)轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，從LB培養(yǎng)皿上挑選紫色單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.2.4 重組菌的構(gòu)建

谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，從培養(yǎng)皿中選取紫色陽(yáng)性克隆進(jìn)行保藏。

1.2.3 培養(yǎng)條件

1.2.3.1 大腸桿菌的培養(yǎng)

含有表達(dá)載體的E.coliDH5α在37 ℃條件下含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB豐富培養(yǎng)基中搖床過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.3.2 谷氨酸棒狀桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

C.glutamicumCICC 20192 pEC-vio和對(duì)照組ATCC 13032 pEC-vio的搖瓶發(fā)酵過(guò)程是：將凍存于-80 ℃冰箱的菌種在含有25 μg/mL硫酸卡那霉素的BHIS平板上劃線活化，挑取單菌落接種到3 mL BHIS培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h；以4%的接種量轉(zhuǎn)接到250 mL三角瓶(25 mL種子培養(yǎng)基)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；以4%的接種量轉(zhuǎn)接到500 mL三角瓶(25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，同時(shí)把培養(yǎng)溫度降為20 ℃，低溫發(fā)酵72 h。

1.2.3.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

菌種在30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6、12、18、24、30 h后，進(jìn)行低溫誘導(dǎo)發(fā)酵，比較紫色桿菌素產(chǎn)量。

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 紫色桿菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取不同質(zhì)量的紫色桿菌素粗提取物干燥粉末，配制終質(zhì)量濃度為0、25、50、75、100、150、200、300 mg/L紫色桿菌素溶液，使用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定其在570 nm(1 cm光程)處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 發(fā)酵體系中紫色桿菌素的測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.4.3 色氨酸的測(cè)定

CICC 20192和ATCC 13032發(fā)酵液中色氨酸的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.1.1 質(zhì)粒圖譜

質(zhì)粒pEC-vio的構(gòu)建基于pEC-XK99E，該質(zhì)粒是以通用的Ptrc為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，同時(shí)在每個(gè)vio基因的前面人為添加來(lái)源谷氨酸棒狀桿菌的保守SD序列。質(zhì)粒圖譜和DNA片段擴(kuò)增結(jié)果分別如圖1、2所示。

圖1 pEC-vio質(zhì)粒圖譜

2.1.2 PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果

在圖2A中，擴(kuò)增的質(zhì)粒骨架pEC大小為6 727 bp，位于DNA Marker 5 kb和8 kb中間，條帶清晰單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增；在圖2 B中，從左到右條帶依次為vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，大小分別為1 340、3 063、1 336、1 150、621 bp。

圖2 DNA片段擴(kuò)增結(jié)果

2.1.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果與質(zhì)粒酶切鑒定

將DNA片段進(jìn)行Golden-gate反應(yīng)后，化學(xué)轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α，圖3為轉(zhuǎn)化結(jié)果。圖中藍(lán)紫色菌落為陽(yáng)性克隆，說(shuō)明質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入并且生成紫色桿菌素。Ptrc作為廣泛使用的誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，在大腸桿菌可以得到同樣表達(dá)。

圖3 pEC-vio在E. coli DH5α中的轉(zhuǎn)化結(jié)果

pEC-vio質(zhì)粒大小14 115 bp，使用Clonemanager軟件進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)對(duì)質(zhì)粒酶切分析，最后確定使用EcoR V將質(zhì)粒限制性切割大小分別為2 025、4 333、7 757 bp，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

2.1.4 谷氨酸棒狀桿菌的電轉(zhuǎn)化結(jié)果

CorynebacteriumglutamicumCICC 201 92的電轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖5所示。在BHIS固體培養(yǎng)基中，出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子剛開(kāi)始是白色的小菌落，然后逐漸變紫，這應(yīng)該是質(zhì)粒出現(xiàn)了泄露表達(dá)現(xiàn)象[12]，過(guò)早表達(dá)了相關(guān)酶蛋白，積累了紫色桿菌素，雖然這會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)前期造成一定的代謝壓力，生長(zhǎng)速率變慢，但是更有利于篩選陽(yáng)性克隆。

2.2 紫色桿菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度的紫色桿菌素粗提取液x(mg/L)與相應(yīng)的570 nm處的吸光度y，擬合的線性關(guān)系為y=0.004 6x+0.005 2，R2=0.998 2，說(shuō)明線性關(guān)系良好。

圖4 pEC-vio的酶切結(jié)果

2.3 發(fā)酵結(jié)果

2.3.1 色氨酸產(chǎn)量

CorynebacteriumglutamicumCICC 20192和ATCC 13032，在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，測(cè)得CICC 20192的L-色氨酸產(chǎn)量為163 mg/L，而野生型并未檢測(cè)到色氨酸，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.3.2 紫色桿菌素的產(chǎn)量

菌株ATCC 13032 pEC-vio和CICC 20192 pEC-vio的紫色桿菌素產(chǎn)量如圖6所示，野生型的菌株并未檢測(cè)到紫色桿菌素，發(fā)酵過(guò)程中也沒(méi)有見(jiàn)到菌體任何變紫的現(xiàn)象；相反，CICC 20192的紫色桿菌素產(chǎn)量達(dá)到了(780±25) mg/L，證實(shí)了以產(chǎn)色氨酸的谷氨酸棒狀桿菌為底盤細(xì)胞異源生產(chǎn)紫色桿菌素是可行的，為通過(guò)代謝工程手段生產(chǎn)紫色桿菌素提供了新的目標(biāo)微生物。

圖6 CICC 20192 pEC-vio紫色桿菌素產(chǎn)量

2.3.3 最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定

從種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，先進(jìn)行30 ℃培養(yǎng)，以快速獲得足夠的生物量再進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)[7]，所以合適的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)紫色桿菌素的積累至關(guān)重要。如圖7所示，接種后18 h進(jìn)行誘導(dǎo)獲得了最大產(chǎn)量，達(dá)到了(1 243±207) mg/L，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚都對(duì)產(chǎn)物的積累不利。

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間的紫色桿菌素產(chǎn)量

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了以產(chǎn)L-色氨酸的Corynebac-teriumglutamicumCICC 20192為底盤細(xì)胞異源表達(dá)紫色桿菌素的可行性。從Janthinobacteriumlividum中分別克隆得到包含有谷氨酸棒狀桿菌保守SD序列的功能基因vioA、vioB、vioC、vioD、vioE，然后與C.glutamicum/E.coli穿梭質(zhì)粒PEC-XK99E通過(guò)Golden-gate DNA裝配方法構(gòu)建質(zhì)粒，在84 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，紫色桿菌素產(chǎn)量達(dá)到了(780±25) mg/L；通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，產(chǎn)量進(jìn)一步提高到(1 243±207) mg/L。

[1] PLATT D, AMARA S, MEHTA T, et al. Viola- cein inhibits matrix metalloproteinase mediated CXCR4 expression: potential anti-tumor effect in cancer invasion and metastasis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 455(1): 107-112.

[2] CHOI S Y, KIM S, LYUCK S, et al. High-level production of violacein by the newly isolatedDuganellaviolaceinigrastr. NI28 and its impact onStaphylococcusaureus[EB/OL]. [2015-10-22]. http: //www. nature. com/articles/srep15598.

[3] BALIBAR C J, WALSH C T.InVitrobiosynthesis of violacein from 1-Tryptophan by the enzymes VioA-E fromChromobacteriumviolaceum[J]. Biochemistry, 2006, 45(51): 15444-15457.

[4] MENDES A S, DE CARVALHO J E, DUARTE M C T, et al. Factorial design and response surface optimization of crude violacein forChromobacteriumviolaceumproduction[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23: 1963-1969.

[5] PANTANELLA F, BERLUTTI F, PASSARIELLO C, et al. Violacein and biofilm production inJanthinobacteriumlividum[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 102(4): 992-999.

[6] WANG H, JIANG P, LU Y, et al. Optimization of culture conditions for violacein production by a new strain ofDuganellasp. B2[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 1(7): 119-124.

[7] RODRIGUES A L, TRACHTMANN N, BECKER J, et al. Systems metabolic engineering ofEscherichiacolifor production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein[J]. Metabolic Engineering, 2013, 20: 29-41.

[8] KANG M S, HAN S S, KIM M Y, et al. High-level expression inCorynebacteriumglutamicumof nitrile hydratase fromRhodococcusrhodochrousfor acrylamide production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(10): 4379-4387.

[9] HILLSON N J, ROSENGARTEN R D, KEASLING J D. j5 DNA assembly design automation software[J]. ACS Synthetic Biology, 2012, 1(1): 14-21.

[10] TAUCH A, KIRCHNER O, L FFLER B, et al. Efficient electrotransformation ofCorynebacteriumdiphtheriaewith a mini-replicon derived from theCorynebacteriumglutamicumplasmid pGA1[J]. Current Microbiology, 2002, 45(5): 362-367.

[11] 程立坤,徐慶陽(yáng),謝希賢,等.HPLC快速測(cè)定發(fā)酵液中L-色氨酸[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào),2010,25(1):9-12.

[12] BILLMAN-JACOBE H, HODGSON A L, LIGHTOWLERS M, et al. Expression of ovine gamma interferon inEscherichiacoliandCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(5): 1641-1645.

The heterologous expression of violacein inCorynebacteriumglutamicum

SUN Hongnian1, BI Changhao2, ZHANG Chunzhi1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China )

The feasibility of heterogenous expression of violacein based on the chassis of aCorynebacteriumglutamicumthat could produce L-Trp was proved. Related biosynthetic pathway genes ofvioA,vioB,vioC,vioD,vioEwere amplified from natural violacein producerJanthinobacteriumlividum, ahead of which the element of conservative SD sequences were added, and constructed withC.glutamicum/E.colipEC-XK99E by Golden-gate DNA assembly method. The heterologous expression of violacein was accomplished inCorynebacteriumglutamicum. The violacein production of (1 243±207) mg/L was obtained in the optimization induction time of shaking-flask batch fermentation for 90 h. The results indicated thatCorynebacteriumglutamicumwas an appropriate host for violacein production.

violacein;Corynebacteriumglutamicum; heterologous expression

2016-02-28.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015AA020202)；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(Y5M2121111).

孫宏年(1990-)，男，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

Q789

A

1674-1404(2017)02-0079-05

孫宏年,畢昌昊,張春枝.紫色桿菌素在谷氨酸棒狀桿菌中異源表達(dá)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(2):79-83.

SUN Hongnian, BI Changhao, ZHANG Chunzhi. The heterologous expression of violacein inCorynebacteriumglutamicum[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(2): 79-83.