肖茜文，王艷蕊，劉 桐，劉 爽，何 苗，任大勇，陳 萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長春 130012）

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌DNA提取方法的比較

肖茜文1，王艷蕊1，劉 桐1，劉 爽1，何 苗2，任大勇1，*陳 萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長春 130012）

采用水煮法、試劑盒法、改良CTAB法、DNA提取液法及TEX裂解液法提取沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，比較5種方法提取的DNA品質(zhì)，選取適用于農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的DNA提取方法。結(jié)果表明，TEX裂解液法提取的DNA純度高、操作簡單、省時省力、成本低，提取的沙門氏菌基因組DNA純度為1.88，質(zhì)量濃度為412.6 ng/μL；金黃色葡萄球菌DNA純度為1.84，質(zhì)量濃度為366.7 ng/μL。以TEX裂解液法提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物有清晰的目的條帶。

沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；基因組DNA提取

食品安全國家標準規(guī)定沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是農(nóng)產(chǎn)品中致病菌檢測的常檢項目；食品安全國家標準食品中致病菌限量規(guī)定，肉制品、糧食制品、即食豆制品、即食果蔬制品（含醬腌菜類）等農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為安全衛(wèi)生必檢項目[1]。為縮短檢測周期，農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可應(yīng)用多重PCR同時檢測，在進行PCR檢測之前需同時快速高效地提取出品質(zhì)優(yōu)良的2種致病菌基因組DNA。

金黃色葡萄球菌細胞壁較厚，不易裂解，有些金黃色葡萄球菌自身還分泌一種耐熱核酸酶可降解核酸，使DNA提取難度加大[2]。目前，提取沙門氏菌基因組DNA的方法有很多，但這些方法并不能同時有效地提取金黃色葡萄球菌基因組DNA。為了提高檢測效率、簡化檢測程序、降低檢測成本、保證檢測正確性，試驗就快速有效提取沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的方法進行研究比較，進而縮短農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的時間，便于實際檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙門氏菌（Salmonella spp.）ASI1859、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CMCC21600，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實驗室保藏菌株；沙門氏菌invA基因特異性引物、金黃色葡萄球菌nuc基因特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，DNA MarkerDL2000、溶菌酶、蛋白酶K等，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器

722E型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；Red-96G型梯度PCR儀，上海山富科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-12C型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

從冷凍管中取出100 μL保存菌液放入100 mL營養(yǎng)肉湯中，于37℃條件下過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌液用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，劃平板，于37℃條件下過夜培養(yǎng)。挑取單菌落至100 mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。菌液于4℃條件下保存，用于基因組DNA的提取。

1.3.2 細菌基因組DNA提取方法

取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌液各1 mL加入1.5 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心2 min，棄上清液，備用。

（1）水煮法。細菌沉淀用滅菌ddH2O洗滌2次，每次100 μL，離心后棄上清液，用100 μL滅菌ddH2O懸浮沉淀，煮沸15 min后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液作為DNA模板，于-20℃條件下保存[3]。

（2）試劑盒法。使用細菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen），參照說明書的操作步驟完成。

（3）TEX裂解液法。細菌沉淀用90 μL TEX裂解液（20mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，1%（V/V）TritonX-100（pH值8.0），加入20 mg/mL溶菌酶）混懸，于37℃條件下孵育30min，再加20mg/mL蛋白酶K 10 μL，于100℃條件下煮沸10 min，離心后取上清液作為DNA模板[4]。

（4）DNA提取液法。細菌沉淀用100 μL DNA提取液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，1.2%（V/V）TritonX-100（pH值8.0））混懸，于56℃條件下孵育30 min，后沸水浴10 min，冰上放置10 min；以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心2 min，上清液即為DNA模板[5]。

（5）改良CTAB法。離心后得到細菌沉淀，進行液氮研磨，依次加入10%SDS 30 μL，高鹽緩沖液（Tris-Cl 50 mmol/L，pH值8.0；EDTA 10 mmol/L；NaCl 0.7 mol/L；CTAB 1.5%）150 μL，80 μL CTAB/ NaCl，并分裝到1.5 mL的離心管中，于60℃條件下水浴40min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），輕輕混勻，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min；取上清液，加入400 μL異丙醇混勻，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干后，用100 μL含有胰RNA酶（20 mg/mL）的TE溶解DNA，于-20℃條件下冷凍保存?zhèn)溆肹6]。

2.4 基因組DNA濃度和純度的測定

提取的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，在紫外分光光度計下測量其在波長260，280 nm處的OD值，計算基因組DNA濃度和純度OD260/280。

2.5 PCR擴增檢測

參照文獻[7]，選擇沙門氏菌invA基因為靶基因，其引物為：正向引物5'-gtcatgatattccgccccatatt-3'，反向引物5'-cggtgcgatgaagtttatcaaag-3'；選擇金黃色葡萄球菌nuc基因為靶基因，其引物為：正向引物5'-gctaagcaaatgcatcataaac-3'，反向引物5'-agcgtt gtcttcgctccaaa-3'。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Star Mix with Loading Dye 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物濃度0.1 μmol/L，加ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。將擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行凝膠成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較5種不同方法提取的基因組DNA

不同方法提取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA比較見表1。

表1 不同方法提取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA比較

為評價不同方法提取的基因組DNA品質(zhì)，分別對5種方法提取的基因組DNA進行濃度和純度比較。由表1可知，水煮法提取的基因組DNA質(zhì)量濃度最高，之后依次為試劑盒法、TEX裂解液法、改良CTAB法、DNA提取液法。水煮法提取的基因組DNA純度最低，原因是水煮法提取的基因組DNA中含有較多的雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)等），符合Psifidi A等人[8]的研究結(jié)果；試劑盒法和TEX裂解液法提取的基因組DNA純度較高，且OD260/280值均在1.8～2.0。試劑盒法提取基因組DNA純度和質(zhì)量濃度都是最為理想的，但是其操作步驟復(fù)雜、成本高；而TEX裂解液法操作簡單、省時省力，大大節(jié)省了檢測成本。

2.2 PCR擴增結(jié)果

不同方法提取基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

圖1 不同方法提取基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

以5種方法提取的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增檢測。由圖1（a）可知，5種方法提取的沙門氏菌DNA均能夠成功用于沙門氏菌invA基因的擴增，目的片段大小為255 bp，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后得到清晰的目的條帶；TEX裂解液法和試劑盒法提取的沙門氏菌基因組DNA擴增產(chǎn)物的目的條帶最為清晰明亮。由圖1（b）可知，除水煮法外其他4種方法提取的金黃色葡萄球菌DNA，均能夠成功用于金黃色葡萄球菌nuc基因的擴增，目的片段大小為506 bp，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后都得到清晰的目的條帶；試劑盒法和TEX裂解液法提取的金黃色葡萄球菌DNA條帶清晰，DNA提取液法提取的DNA擴增條帶有拖尾現(xiàn)象。

2.3 多重PCR檢測TEX裂解法提取的基因組DNA

以TEX裂解液法提取的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

多重PCR檢測TEX裂解液法提取的基因組DNA見圖2。

3 討論

細菌基因組DNA提取制備的品質(zhì)是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，如果提取時不能完全釋放DNA，或未去除干凈的蛋白質(zhì)、有機試劑殘留在所制備的模板中，都可能導(dǎo)致后續(xù)的PCR反應(yīng)效率和靈敏度降低，甚至導(dǎo)致反應(yīng)失敗。目前，細菌基因組DNA的提取方法有很多，試驗選擇5種提取方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取效果進行比較。找到簡易高效、穩(wěn)定可靠同時提取沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的方法，用于農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測。

圖2 多重PCR檢測TEX裂解液法提取的基因組DNA

水煮法所需費用低、操作簡單、耗時短，與其他方法相比，提取的基因組DNA質(zhì)量濃度顯著增加，但DNA純度顯著降低，同時因為金黃色葡萄球菌細胞壁較厚，水煮法并不能對其進行有效地提取。改良CTAB法是目前最常用的基因組DNA提取方法，所需費用低，但操作繁瑣、耗時長、DNA損失量大，且使用的有機溶劑有污染和毒性作用。試驗使用改良CTAB法提取DNA的OD260/280值不理想，可能是殘留的有機溶劑或所用溶劑去除蛋白的能力有限所導(dǎo)致，與Murray J R等人研究結(jié)果相同[9]。TEX裂解液法和DNA提取液法避免了有機溶劑對人體的危害，操作省時省力。TEX裂解液法樣本裂解更為充分,蛋白質(zhì)消化更為完全，溶菌酶使金黃色葡萄球菌破除細胞壁，釋放細胞內(nèi)DNA。商業(yè)試劑盒法提取基因組DNA效率高且可減少有機試劑對人體的傷害，近年來得到普遍的認可和應(yīng)用，但是商業(yè)試劑盒成本較高，如不考慮成本的因素，試劑盒法最為理想。在實際現(xiàn)場檢測過程中，需要大批量檢測樣本，基層單位在檢測過程中對成本的限制較大，需要在保證檢測品質(zhì)的同時降低成本，以適應(yīng)市場的需求。TEX裂解液法在保證提取DNA品質(zhì)的同時，成本大大低于試劑盒法。

因沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為農(nóng)產(chǎn)品致病菌檢測中必檢項目，通過多重PCR可對2種致病菌進行同時檢測。經(jīng)試驗比較后，選擇TEX裂解液法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA進行同時提取，為后續(xù)PCR檢測找到了經(jīng)濟適用、操作簡單快速的基因組DNA提取方法。

[1]中華人民共和國國家標準.食品安全國家標準食品中致病菌限量GB 29921—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.

[2]唐俊妮.金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶相關(guān)基因的功能與特征分析 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007．

[3]Gussow D，Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J]. Nucleic Acids Res，1989，17（10）：4 000-4 010．

[4]金姝，鄒玉涵，閆佩毅，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌DNA提取方法的改進 [J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（3）：303-305.

[5]中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準委員會.出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增檢測方法第一部分：金黃色葡萄球菌：SN/T 2754.1—2011[S].北京：中國標準出版社，2011.

[6]賈愛榮，張永剛，王萍，等.食品檢測中革蘭氏陽性菌DNA提取新方法的研究 [J].食品工業(yè)，2011（12）：104-107.

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[9]Murray J R，Rajevan M S.Evaluation of DNA extraction from granulocytes discarded in the separation medium after isolation of peripheral blood mononuclear cells and plasma from whole blood[J].MBC Research.，2013（6）：440-444.

A Comparative Study on Salmonella spp.and Staphylococcus aureus DNA Extraction Methods

XIAO Qianwen1，WANG Yanrui1，LIU Tong1，LIU Shuang1，HE Miao2，REN Dayong1，*CHEN Ping1
（1.Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2.Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

To extract Salmonella spp.and Staphylococcus aureus DNA by the methods of boiling water extraction，kit assay，improved CTAB method，DNA extracting solution method and TEX cracking liquid method，compare the quality of the extracted DNA by the five methods.Choosing an extraction method applied to multiplex PCR detection of Salmonella spp.and Staphylococcus aureus in agricultural products.The results show that TEX cracking liquid method to extract high purity of DNA，simple operation，save time and effort，low costs.The purity of Salmonella DNA is 1.88，and the concentration is 412.6 ng/μL；the purity of Staphylococcus aureus DNA is 1.84 with the concentration 366.7 ng/μL by using the TEX cracking liquid method.The extraction of DNA by PCR can amplify objective band with extraction DNA as template.

Salmonella spp.；Staphylococcus aureus；genome DNA extraction

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.015

1671-9646（2017）02a-0048-03

2016-12-01

吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項目資助（2014Y106）。

肖茜文（1990— ），女，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：陳 萍（1968— ），女，博士，教授，研究方向為食品質(zhì)量與安全。