馬雪豐，張景耀，毛 慶，陳 果，秦德萍，李 傲,3*

·論著·

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1-非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸-二甲基精氨酸二甲胺水解酶1路徑在肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化大鼠組織中的作用及意義

馬雪豐1，張景耀2，毛 慶1，陳 果1，秦德萍1，李 傲2,3*

目的 觀察蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)-非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(ADMA)-二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)代謝軸在肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型體內(nèi)的變化情況，并探討血清ADMA水平與肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化程度間的相關(guān)性。方法 2015年9—12月，從40只SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠中隨機(jī)抽取20只，將其平均分為溶劑對(duì)照組(A組)和肝纖維化模型組(B組)；再將剩余的20只Sprague-Dawley大鼠平均分為假手術(shù)組(C組)和模型組(D組)，各10只。采用四氯化碳(CCl4)慢性染毒和單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方法分別建立大鼠肝纖維化模型(B組)和腎小管間質(zhì)纖維化模型(D組)。采用皮下注射等量花生油和單側(cè)輸尿管只分離不結(jié)扎的方法分別建立溶劑對(duì)照模型(A組)和假手術(shù)模型(C組)。A、B組大鼠分別于干預(yù)8周后，C、D組大鼠分別于干預(yù)2周后，采用Masson三色染色后計(jì)算肝、腎膠原纖維面積百分比；采用化學(xué)比色法檢測(cè)肝、腎組織羥脯氨酸(Hyp)水平；采用改良的高效液相色譜法檢測(cè)血清ADMA水平；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)肝、腎組織PRMT1、DDAH1表達(dá)水平。結(jié)果 A組、B組、C組、D組大鼠血清ADMA水平分別為(0.43±0.07)、(1.10±0.21)、(0.45±0.03)、(1.26±0.21)μmol/L。B組大鼠血清ADMA水平高于A組(t=6.32，P<0.05)；D組血清ADMA水平高于C組(t=6.96，P<0.05)。血清ADMA水平與肝、腎膠原纖維面積百分比均呈正相關(guān)(r值分別為0.913、0.934，P<0.05)。血清ADMA水平與肝、腎組織Hyp水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.856、0.878，P<0.05)。B組大鼠肝組織PRMT1表達(dá)水平高于A組，DDAH1表達(dá)水平低于A組(P<0.05)。D組大鼠腎組織PRMT1表達(dá)水平高于C組，DDAH1表達(dá)水平低于C組(P<0.05)。結(jié)論 在肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化狀態(tài)下，PRMT1-ADMA-DDAH1代謝軸中PRMT1表達(dá)增高，而DDAH1表達(dá)減低，可導(dǎo)致血清ADMA水平升高，引起肝血竇和腎小管周?chē)?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而參與纖維化進(jìn)程的啟動(dòng)和病理改變的發(fā)生。

纖維化；模型，動(dòng)物；蛋白質(zhì)精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶；非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸

馬雪豐，張景耀，毛慶，等.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1-非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸-二甲基精氨酸二甲胺水解酶1路徑在肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化大鼠組織中的作用及意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(12)：1474-1479.[www.chinagp.net]

MA X F,ZHANG J Y,MAO Q，et al.Role and significance of PRMT1-ADMA-DDAH1 pathway in rats with hepatic and renal tubulointerstitial fibrosis[J].Chinese General Practice，2017，20(12)：1474-1479.

1.ChonggingInstituteforFoodandDrugControl,Chongqing401121,China

2.CollegeofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China

3.StateKeyLaboratoryofQualityResearchinChineseMedicine,InstituteofChineseMedicalSciences,UniversityofMacau,Macau999078,China

*Correspondingauthor:LIAo，Associateprofessor;E-mail:ao_livip@sina.com

纖維化是一種組織病理學(xué)概念,幾乎所有的組織器官，包括心、肺、肝、腎、皮膚等均可發(fā)生纖維化[1]。器官纖維化進(jìn)程的持續(xù)發(fā)展可進(jìn)一步破壞器官結(jié)構(gòu)，最終引起器官衰竭[2-3]。在不同的組織器官中，雖然纖維化的發(fā)病機(jī)制和過(guò)程存在差別，但現(xiàn)在仍無(wú)有效的措施延緩纖維化的發(fā)生、發(fā)展[4]。因此，尋找并鑒定出纖維化相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物不僅可以提高人們對(duì)纖維化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還能為抗纖維化治療藥物提供新的靶點(diǎn)。非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)作為內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制物，已在心血管疾病和腎臟疾病中受到廣泛關(guān)注[5-6]。ADMA在體內(nèi)的生成主要通過(guò)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(protein arginine methyltransferase,PRMT1)催化生成。體內(nèi)ADMA的最終清除通過(guò)二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(dimethylamino hydrolase,DDAH1)完成，其催化ADMA轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼岷投装穂7]。已有多項(xiàng)證據(jù)表明，ADMA在預(yù)示慢性腎病及心血管并發(fā)癥的發(fā)生乃至死亡方面具有重要意義[6-7]。同時(shí)，在乙型肝炎肝纖維化患者體內(nèi)，也出現(xiàn)了DDAH1活性的降低和ADMA水平的升高[8]。然而，在纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，尚未有動(dòng)物血清中ADMA水平及其相關(guān)代謝酶表達(dá)水平的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建了四氯化碳(CCl4)慢性染毒的大鼠肝纖維化模型和單側(cè)輸尿管結(jié)扎的大鼠腎小管間質(zhì)纖維化模型，擬通過(guò)經(jīng)典的肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化模型，考察其是否也存在與臨床相似的PRMT1-ADMA-DDAH1代謝軸紊亂，并進(jìn)一步探討纖維化模型動(dòng)物血清中ADMA水平與纖維化程度間的相關(guān)性，旨在為纖維化性疾病的診斷及鑒別提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及時(shí)間

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠40只，均為雄性，6～7周齡，體質(zhì)量180～220 g，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(渝)2012-0005〕。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作在第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行〔SYXK(軍)2007-0037〕，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予Sprague-Dawley大鼠人道關(guān)懷。飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度55%，自由進(jìn)食及飲水，12 h明/12 h暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鄰苯二甲醛、三巰基丙酸(美國(guó)Sigma公司)，ADMA標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Cayman公司),色譜級(jí)乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司)，固相萃取陽(yáng)離子交換柱Waters Oasis MCX (60 mg/3 ml),兔抗大鼠PRMT1多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔或小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，小鼠抗大鼠DDAH1單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，Masson染液、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sartorius公司)；氮吹儀(瑞典Biotage公司)；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司)；041BR88778型蛋白電泳和電轉(zhuǎn)移裝置、ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；T10B型電動(dòng)組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司)；BX53正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2015年9—12月。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立

1.2.1.1 肝纖維化模型建立 大鼠肝纖維化模型建立參照文獻(xiàn)[9]。從40只Sprague-Dawley大鼠中隨機(jī)抽取20只，再將20只Sprague-Dawley大鼠平均分為溶劑對(duì)照組(A組)和肝纖維化模型組(B組)，各10只。B組大鼠在造模第1周飲用0.03%苯巴比妥(苯巴比妥30 mg溶于100 ml純凈水)以誘導(dǎo)混合功能氧化酶活性，增加CCl4代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高造模成功率，減少造模時(shí)間。造模大鼠首次皮下注射含40% CCl4的花生油混合液，5 ml/kg皮下注射，以后每次皮下注射2 ml/kg，每周2次，連續(xù)注射8周誘導(dǎo)肝纖維化模型。A組大鼠按相同方法和劑量皮下注射等量花生油。

1.2.1.2 腎小管間質(zhì)纖維化模型建立 采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型[10]。將剩余的20只Sprague-Dawley大鼠平均分為假手術(shù)組(C組)和模型組(D組)，各10只。Sprague-Dawley大鼠以水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，D組大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)，用眼科鑷分離左側(cè)輸尿管，距腎門(mén)5～7 mm處用4號(hào)絲線(xiàn)上下結(jié)扎兩處，從中剪斷輸尿管，最后逐層縫合皮下組織及皮膚。C組大鼠在暴露腎臟后，只分離左側(cè)輸尿管不結(jié)扎，直接分層縫合皮膚。

1.2.2 標(biāo)本采集 A、B組大鼠分別于干預(yù)8周后，C、D組大鼠分別于干預(yù)2周后，腹腔注射l%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，收集腹主動(dòng)脈血，檢測(cè)血清ADMA水平。同時(shí)暴露腹腔，分別切取纖維化肝左外葉以及結(jié)扎側(cè)腎組織，制作5 μm石蠟切片，用于組織病理學(xué)檢查。

1.2.3 肝、腎組織病理檢查及半定量組織學(xué)評(píng)分 石蠟切片常規(guī)脫蠟，經(jīng)HE染色后于200倍光鏡下觀察組織切片的病理變化。

半定量組織學(xué)評(píng)分：將肝纖維化分為5個(gè)等級(jí)，0級(jí)(計(jì)1分)：無(wú)肝纖維化；1級(jí)(計(jì)2分)：膠原纖維從中央靜脈或匯管區(qū)向外延伸；2級(jí)(計(jì)3分)：膠原纖維延伸明顯，纖維間隔開(kāi)始形成；3級(jí)(計(jì)4分)：膠原纖維不全分隔包繞肝小葉；4級(jí)(計(jì)5分)：纖維結(jié)締組織在全小葉多處彌漫性增生，膠原纖維包繞分隔肝小葉，假小葉形成。觀察大鼠腎組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死情況，腎間質(zhì)增寬等病變程度，并按病變程度分為5個(gè)等級(jí)，0級(jí)(計(jì)1分):正常；1級(jí)(計(jì)2分)：病變范圍為1%～24%；2級(jí)(計(jì)3分)：病變范圍為25%～50%；3級(jí)(計(jì)4分)：病變范圍為51%～75%；4級(jí)(計(jì)5分)，病變范圍>75%。

Masson三色染色后，在200倍光鏡下觀察組織切片，采用Image Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，分析膠原纖維面積百分比，計(jì)算方法為(膠原纖維面積/肝、腎組織面積)×100%。

1.2.4 肝、腎組織Hyp水平測(cè)定 采用化學(xué)比色法檢測(cè)肝、腎組織Hyp水平。精確稱(chēng)取大鼠肝左外葉、腎組織各100 mg，嚴(yán)格按照Hyp測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作；將Hyp標(biāo)準(zhǔn)品配成標(biāo)準(zhǔn)液，蒸餾水為空白對(duì)照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算肝、腎組織Hyp水平。

1.2.5 血清ADMA水平測(cè)定 采用改良的高效液相色譜法[11-12]檢測(cè)血清ADMA水平。色譜條件為：流動(dòng)相采用磷酸鹽緩沖溶液(25 mmol/L，pH=6.5)：乙腈(90∶10)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；激發(fā)波長(zhǎng)：340 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)：455 nm；將ADMA標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mmol/L HCl中，配制成濃度為1.0 mmol/L的存儲(chǔ)溶液。然后將存儲(chǔ)溶液稀釋成濃度為0.05 μmol/L、0.50 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L、10.00 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。以ADMA標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)血清中ADMA水平進(jìn)行定性檢測(cè)，采用外標(biāo)峰面積法對(duì)血清中ADMA水平進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.6 肝、腎組織PRMT1、DDAH1表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)肝、腎組織PRMT1、DDAH1表達(dá)水平。分別稱(chēng)取大鼠肝左外葉、腎組織各100 mg，采用BCA比色法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。將蛋白樣品進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，結(jié)果采用Quantity One軟件定量分析各條帶的積分吸光度(IA)值。將檢測(cè)到的PRMT1、DDAH1與各自?xún)?nèi)參β條帶IA值比值作為衡量參數(shù)，分析肝、腎組織中PRMT1、DDAH1表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝、腎組織病理學(xué)改變 HE染色后200倍光鏡下顯示，A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周整齊排列，肝細(xì)胞大小均勻，無(wú)變性和壞死(見(jiàn)圖1A，本文圖1彩圖見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章)；B組大鼠肝細(xì)胞發(fā)生大面積脂肪變性和壞死，大量的纖維組織在肝小葉內(nèi)伸展，并與鄰近匯管區(qū)及中央靜脈相連，纖維間隔較厚，分割包繞肝實(shí)質(zhì)，形成大小不一的假小葉(見(jiàn)圖1B)。半定量組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，B組大鼠半定量組織學(xué)評(píng)分〔(3.40±0.23)分〕高于A組〔(0.28±0.14)分〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.96，P<0.05)。Masson三色染色法結(jié)果顯示，A組大鼠僅在肝組織匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)血管壁附著藍(lán)色，無(wú)明顯膠原增生(見(jiàn)圖1C)；B組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝組織匯管區(qū)和肝小葉間膠原纖維明顯增生，形成薄厚不一的纖維間隔，分割包繞肝實(shí)質(zhì)(見(jiàn)圖1D)。B組大鼠肝膠原纖維面積百分比〔(34.9±1.7)%〕大于A組〔(2.4±0.8)%〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=55.98，P<0.05)。同時(shí)，B組大鼠肝組織中Hyp水平〔(820±29)μg/g〕高于A組〔(493±84)μg/g〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.59，P<0.05)。以上結(jié)果提示肝纖維化模型成功建立。

HE染色后200倍光鏡下顯示，C組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)腎小管擴(kuò)張、小管上皮細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1E)；D組大鼠腎臟組織中腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，但出現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張，小管間質(zhì)中出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，小管上皮細(xì)胞部分脫落、壞死等情況(見(jiàn)圖1F)。半定量組織學(xué)評(píng)分結(jié)果提示，D組大鼠半定量組織學(xué)評(píng)分〔(3.70±0.17)分〕高于C組〔(0.31±0.20)分〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.81，P<0.05)。Masson三色染色法結(jié)果顯示，C組大鼠腎小球基底膜、腎小管基底膜、系膜基質(zhì)染成藍(lán)色，腎間質(zhì)無(wú)明顯膠原纖維(見(jiàn)圖1G)；D組大鼠腎間質(zhì)部位明顯增寬，存在大量的膠原沉積(見(jiàn)圖1H)。D組大鼠腎膠原纖維面積百分比〔(34.8±2.2)%〕大于C組〔(0.9±0.8)%〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=45.79，P<0.05)。同時(shí)，D組大鼠腎組織Hyp水平〔(372±60)μg/g〕高于C組〔(145±26)μg/g〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.01，P<0.05)。以上結(jié)果提示腎間質(zhì)纖維化模型成功建立。

2.2 各組大鼠血清ADMA水平比較 A組、B組、C組、D組大鼠血清ADMA水平分別為(0.43±0.07)、(1.10±0.21)、(0.45±0.03)、(1.26±0.21)μmol/L。B組大鼠血清ADMA水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.32，P<0.05)；D組血清ADMA水平高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.96，P<0.05)。

2.3 血清ADMA水平與肝、腎膠原纖維面積百分比及肝、腎組織Hyp水平的相關(guān)性分析 血清ADMA水平與肝、腎膠原纖維面積百分比均呈正相關(guān)(r值分別為0.913、0.934，P<0.05，見(jiàn)圖2A～B)。血清ADMA水平與肝、腎組織Hyp水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.856、0.878，P<0.05,見(jiàn)圖2C～D)。

注：A、B、E、F為HE染色，C、D、G、H為Masson三色染色；A和C為溶劑對(duì)照組(A組)，B和D為肝纖維模型組(B組)，E和G為假手術(shù)組(C組)，F(xiàn)和H為模型組(D組)

圖1 肝、腎組織病理檢查(×200)

Figure 1 Histopathological examination of hepatic and renal tissue

注：ADMA=非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸

圖2 血清ADMA水平與肝、腎膠原纖維面積百分比及肝、腎組織Hyp水平的相關(guān)性分析

Figure 2 Correlation analysis of serum ADMA levels with the percentages of areas of hepatic and renal collagen fibers,and with the level of Hyp in hepatic and renal tissue

2.4 各組大鼠肝、腎組織PRMT1、DDAH1表達(dá)水平比較 B組大鼠肝組織PRMT1表達(dá)水平(0.39±0.04)高于A組(0.19±0.05)，DDAH1表達(dá)水平(0.42±0.10)低于A組(1.20±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.55、12.69，P<0.05)。D組大鼠腎組織PRMT1表達(dá)水平(1.80±0.12)高于C組(0.92±0.14)，DDAH1表達(dá)水平(0.46±0.04)低于C組(1.05±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.23、7.17，P<0.05，見(jiàn)圖3)。

注：PRMT1=蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1，DDAH1=二甲基精氨酸二甲胺水解酶1

圖3 各組大鼠肝、腎組織PRMT1、DDAH1表達(dá)情況

Figure 3 Expression levels of PRMT1 and DDAH1 in hepatic and renal tissues of rats

3 討論

目前，纖維化的診斷治療主要依賴(lài)于組織穿刺病理檢查，但易受患者病情、依從性以及活檢取樣的誤差性和創(chuàng)傷性等限制。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)一個(gè)真正意義上明確診斷纖維化的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。近年來(lái)大量文獻(xiàn)表明，作為內(nèi)源性NOS的抑制劑，ADMA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS，減少NO的合成，不僅可收縮血管平滑肌，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，還可以通過(guò)誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞趨化和浸潤(rùn)，參與炎性反應(yīng)[13-14]。在CCl4或膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)NOS合成NO的能力下降，從而使阻力血管的緊張性增加，介導(dǎo)肝硬化門(mén)脈高壓癥形成[15]。同時(shí)，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷常會(huì)引發(fā)竇壁結(jié)構(gòu)改變，竇壁血管改變一方面阻礙了血氧彌散進(jìn)入竇狀隙(Disse腔)，引起肝星狀細(xì)胞(HSCs)的缺氧和激活，誘發(fā)肝纖維化的發(fā)生；另一方面妨礙肝細(xì)胞從Disse腔攝取營(yíng)養(yǎng)和氧氣，加重肝細(xì)胞損傷或引起其凋亡，此時(shí)正常肝細(xì)胞膜對(duì)HSCs的接觸性抑制作用喪失，從而間接引起HSCs增殖[16]。另有研究顯示，當(dāng)腎小管周?chē)?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，同樣可以引起細(xì)胞和組織缺氧，引發(fā)炎性反應(yīng)[17]。通過(guò)基因敲除或特異性抑制誘生型NOS(iNOS)活性的方式，可導(dǎo)致單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎小管間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中L-精氨酸(NO合成的前體)水平上調(diào)，加速模型大鼠的腎臟纖維化進(jìn)程。此項(xiàng)研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，NO水平越低，纖維化的程度越顯著[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在CCl4誘導(dǎo)和單側(cè)輸尿管結(jié)扎的大鼠肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化模型中，ADMA在大鼠血清中的水平均高于各自的對(duì)照大鼠；同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)血清ADMA水平與肝、腎膠原纖維面積百分比及Hyp水平呈正相關(guān)性，提示在肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化疾病中，ADMA可通過(guò)抑制NO的生成，引起肝血竇和腎小管周?chē)?xì)血管收縮和微循環(huán)障礙，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，這可能是纖維化疾病共有的始動(dòng)因素和病理變化。

體內(nèi)ADMA水平主要由PRMT1、DDAH1表達(dá)和活性來(lái)調(diào)節(jié)，從而形成一條PRMT1-ADMA-DDAH1代謝軸。通過(guò)研究PRMT1-ADMA-DDAH1代謝軸在臟器纖維化發(fā)生過(guò)程中的作用，可為纖維化疾病的診斷及研發(fā)有效的治療手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)和單側(cè)輸尿管結(jié)扎的纖維化模型大鼠中，ADMA水平升高同時(shí)受到PRMT1表達(dá)上調(diào)和DDAH1表達(dá)降低的調(diào)控。因此，通過(guò)下調(diào)PRMT1和/或上調(diào)DDAH1活性或表達(dá)水平，降低血清中ADMA水平，可能是預(yù)防或逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程的有效途徑。

綜上所述，肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化大鼠體內(nèi)存在有紊亂的ADMA-PRMT1-DDAH1代謝軸，尤其是血清中ADMA水平的升高，與纖維化惡性程度存在明顯的正相關(guān)性。針對(duì)現(xiàn)有的肝纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化血清學(xué)指標(biāo)，普遍存在陽(yáng)性檢出率不高，更不能替代組織活檢這一金標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)實(shí)，本課題組擬進(jìn)一步開(kāi)展臨床患者血清ADMA水平的檢測(cè)，并通過(guò)評(píng)價(jià)該指標(biāo)的各項(xiàng)診斷效能(靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陰性似然比、陽(yáng)性似然比、診斷準(zhǔn)確率、約登指數(shù)等)，為其成為纖維化疾病的治療和預(yù)后判定指標(biāo)提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：馬雪豐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、撰寫(xiě)論文、資料收集整理；張景耀、毛慶、陳果、秦德萍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施；李傲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、質(zhì)量控制并對(duì)文章負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。

[1]WYNN T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J].J Pathol,2008,214(2):199-210.DOI:10.1002/path.2277.

[2]WYNN T A.Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases[J].J Clin Invest,2007,117(3):524-529.

[3]孫輝，李建生，謝洋.重視特發(fā)性肺纖維化的并發(fā)癥[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(26)：3248-3252.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.032. SUN H,LI J S,XIE Y.Complications of idiopathic pulmonary fibrosis should be attached more importance[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3248-3252.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.032.

[4]GHOSH A K,QUAGGIN S E,VAUGHAN D E.Molecular basis of organ fibrosis:potential therapeutic approaches[J].Exp Biol Med(Maywood),2013,238(5):461-481.DOI:10.1177/1535370213489441.

[5]ELESBER A A,SOLOMON H,LENNON R J,et al.Coronary endothelial dysfunction is associated with erectile dysfunction and elevated asymmetric dimethylarginine in patients with early atherosclerosis[J].Eur Heart J,2006,27(7):824-831.

[6]MATSUMOTO Y,UEDA S,YAMAGISHI S,et al.Dimethylarginine dimethylaminohydrolase prevents progression of renal dysfunction by inhibiting loss of peritubular capillaries and tubulointerstitial fibrosis in a rat model of chronic kidney disease[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(5):1525-1533.

[7]B?GER R H.Asymmetric dimethylarginine(ADMA) and cardiovascular disease:insights from prospective clinical trials[J].Vasc Med,2005,10(2):S19-25.

[8]羅新華，程明亮，張權(quán)，等.乙型肝炎肝纖維化組織差異蛋白的篩選及DDAH1的功能研究[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，33(6):614-618.DOI：10.3969/j.issn.1000-2707.2008.06.012. LUO X H，CHENG M L，ZHANG Q，et al.A study on the differential proteins and functions of DDAH1 in human hepatitis B derived hepatic fibrosis tissues[J].Journal of Guiyang Medical College，2008，33(6):614-618.DOI：10.3969/j.issn.1000-2707.2008.06.012.

[9]張曉珣，王俊，趙宇，等.牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的治療作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30(1):53-60.DOI：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.01.008. ZHANG X X，WANG J，ZHAO Y，et al.Therapeutic effect of arctigenin on carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats[J].Chinese Journal of Pharmacology & Toxicology，2016，30(1):53-60.DOI：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.01.008.

[10]CHEVALIER R L,FORBES M S,THORNHILL B A.Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy[J].Kidney Int,2009,75(11):1145-1152.DOI:10.1038/ki.2009.86.

[11]HERESZTYN T,WORTHLEY M I,HOROWITZ J D.Determination of L-arginine and NG,NG- and NG,NG′- dimethyl-L-arginine in plasma by liquid chromatography as AccQ-Fluor fluorescent derivatives[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,805(2):325-329.

[12]BLACKWELL S,O′REILLY D S,TALWAR D K.HPLC analysis of asymmetric dimethylarginine(ADMA) and related arginine metabolites in human plasma using a novel non-endogenous internal standard[J].Clin Chim Acta,2009,401(1/2):14-19.DOI:10.1016/j.cca.2008.10.032.

[13]ZOCCALI C,BENEDETTO F A,MAAS R,et al.Asymmetric dimethylarginine,C-reactive protein,and carotid intima-media thickness in end-stage renal disease[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(2):490-496.

[14]Rockey D C,Chung J J.Reduced nitric oxide production by endothelial cells in cirrhotic rat liver:endothelial dysfunction in portal hypertension[J].Gastroenterology,1998,114(2):344-351.

[15]GUPTA T K,TORUNER M,CHUNG M K,et al.Endothelial dysfunction and decreased production of nitric oxide in the intrahepatic microcirculation of cirrhotic rats[J].Hepatology,1998,28(4):926-931.

[16]陸雄，劉平.肝纖維化過(guò)程中一個(gè)重要的病理改變─肝竇毛細(xì)血管化[J].中華肝臟病雜志，2001，9(1):53-54.DOI：10.3760/j.issn:1007-3418.2001.01.034. LU X,LIU P.An important pathological change in the process of hepatic fibrosis-hepatic sinusoid[J].Chinese Journal of Hepatology，2001，9(1):53-54.DOI：10.3760/j.issn:1007-3418.2001.01.034.

[17]HOCHBERG D,JOHNSON C W,CHEN J,et al.Interstitial fibrosis of unilateral ureteral obstruction is exacerbated in kidneys of mice lacking the gene for inducible nitric oxide synthase[J].Lab Invest,2000,80(11):1721-1728.

(本文編輯：毛亞敏)

Role and Significance of PRMT1-ADMA-DDAH1 Pathway in Rats with Hepatic and Renal Tubulointerstitial Fibrosis

MAXue-feng1,ZHANGJing-yao2,MAOQing1,CHENGuo1,QINDe-ping1,LIAo2,3*

Objective To study the changes of protein-arginine N-methyltransferases 1(PRMT1)-asymmetrical dimethylarginine(ADMA)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1(DDAH1) axis in rat models of hepatic and renal tubulointerstitial fibrosis,and discuss the correlation between serum ADMA levels and degree of fibrosis.Methods From September to December 2015,20 Sprague-Dawley rats were randomly selected from 40 male SPF Sprague-Dawley rats,and equally divided into control group of solvent(group A) and model group of hepatic fibrosis(group B);the remaining 20 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group(group C) and model group(group D),each had 10 rats.The rat models of hepatic fibrosis(group B) and tubulointerstitial fibrosis(group D) were established by chronic exposure to carbon tetrachloride(CCl4) and unilateral ureteral obstruction.The solvent control model(group A) and sham operation model(group C) were established by subcutaneous injection of the same amount of peanut oil and unilateral ureteral separation without ligation respectively.After 8-week and 2-week intervention for rats in group A and B,group C and D respectively,Masson trichrome staining method was calculated percentages of areas of hepatic and renal collagen fibers;the levels of hydroxyproline(Hyp) in hepatic and renal were detected by chemical colorimetry.Serum ADMA levels were measured by the modified HPLC method.The expression levels of PRMT1 and DDAH1 in hepatic and renal tissues were detected by Western blotting.Results The serum ADMA levels of group A,group B,group C and group D were(0.43±0.07)(1.10±0.21)(0.45±0.03)(1.26±0.21) μmol/L respectively.The serum ADMA level of group B was higher than that of group A(t=6.32,P<0.05).The serum ADMA level of group D was higher than that of group C(t=6.96，P<0.05).There was a positive correlation between the ADMA level in serum and the percentage of areas of hepatic and renal collagen fibers(r=0.913,0.934 respectively,P<0.05).There was a positive correlation between the ADMA level in serum and the level of Hyp in hepatic and renal tissues(r=0.856,0.878 respectively,P<0.05).The expression level of PRMT1 in hepatic tissues of group B was higher than that of group A,while its expression level of DDAH1 was lower than that of group A(P<0.05).The expression level of PRMT1 in renal tissues of group D was higher than that of group C,while its expression level of DDAH1 was lower than that of group C(P<0.05).Conclusion Under the condition of hepatic and renal fibrosis,increased expression of PRMT1 and decreased expression of DDAH1 in PRMT1-ADMA-DDAH1 can lead to elevated levels of serum ADMA,cause damages of capillary endothelial cells around hepatic sinusoids and renal tubules,and thus involve in the initiation of and pathological changes of the fibrosis process.

Fibrosis;Models，animal;Protein-arginine N-methyltransferases;Asymmetrical dimethylarginine

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81001675)；重慶市科委前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究(一般)項(xiàng)目(cstc2014jcyjA10030)

R 364.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.013

2016-09-12；

2017-01-02)

1.401121重慶市，重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院

2.400054重慶市，重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院

3.999078澳門(mén)，澳門(mén)大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

*通信作者：李傲，副教授；E-mail:ao_livip@sina.com