紀 昕，王 鑫，岳曉樂，趙丹丹，郭玉楷，李永軍

·論著·

eNOS、CAV1、PI3K/Akt信號通路在同型半胱氨酸促進大鼠血管平滑肌細胞遷移、增殖中的作用研究

紀 昕，王 鑫，岳曉樂，趙丹丹，郭玉楷，李永軍*

目的 探討內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、小凹蛋白-1(CAV1)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路在同型半胱氨酸(Hcy)促進大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移、增殖中的作用。方法 2016年1—6月采用組織貼塊法分離SDF級SD大鼠胸主動脈中膜并傳代培養(yǎng)VSMCs，取4～7代細胞用于實驗。細胞分為4組，分別為空白對照組、100 μmol/L Hcy組、200 μmol/L Hcy組、500 μmol/L Hcy組，使用相應(yīng)濃度Hcy(0、100、200、500 μmol/L)進行干預(yù)培養(yǎng)，采用Transwell法檢測VSMCs遷移能力、MTT法檢測VSMCs增殖情況〔以光密度(OD)值表示〕，硝酸還原酶法測定VSMCs 釋放NO情況，Western blotting檢測VSMCs eNOS、CAV1、PI3K、p-Akt蛋白表達情況。結(jié)果 VSMCs穿膜細胞數(shù)與Hcy濃度呈正相關(guān)(r=0.582,P=0.020)。OD值與Hcy濃度呈正相關(guān)(r=0.620,P=0.015)。100、200、500 μmol/L Hcy組釋放NO低于空白對照組(P<0.05)。NO(r=-0.479，P=0.028)，eNOS蛋白表達水平(r=-0.544,P=0.033)與Hcy濃度呈負相關(guān)。NO與eNOS蛋白表達水平呈正相關(guān)(r=0.721，P=0.009)。100、200、500 μmol/L Hcy組VSMCs CAV1、PI3K、p-Akt蛋白表達水平均高于空白對照組(P<0.05)。CAV1蛋白表達水平(r=0.505,P=0.042)，PI3K蛋白表達水平(r=0.428，P=0.030)、p-Akt蛋白表達水平(r=0.389，P=0.047)與Hcy濃度均呈正相關(guān)。結(jié)論 Hcy可能通過促進CAV1蛋白表達，抑制eNOS活性和NO釋放，活化PI3K/Akt信號通路，從而誘導(dǎo)VSMCs的遷移和增殖，導(dǎo)致動脈粥樣硬化。

半胱氨酸；肌細胞，平滑肌；一氧化氮合酶；小凹蛋白；磷脂酰肌醇3-激酶

紀昕，王鑫，岳曉樂，等.eNOS、CAV1、PI3K/Akt信號通路在同型半胱氨酸促進大鼠血管平滑肌細胞遷移、增殖中的作用研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(12)：1469-1473.[www.chinagp.net]

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高同型半胱氨酸(Hcy)是動脈粥樣硬化(AS)的獨立危險因素，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[1]。AS的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮細胞損傷和血管平滑肌細胞(VSMCs)的遷移、增殖密切相關(guān)。已有研究表明，Hcy可誘導(dǎo)VSMCs的遷移、增殖[2-4]，但其具體機制目前尚不清楚，有研究認為可能與其對內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性和一氧化氮(NO)釋放的影響有關(guān)[5-6]。小凹蛋白-1(CAV1)是平滑肌細胞膜小凹的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其可與eNOS結(jié)合形成復(fù)合物，進而調(diào)控細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-8]，是eNOS的負性調(diào)節(jié)因子。因此推測Hcy可能通過誘導(dǎo)CAV1的表達，抑制eNOS和NO作用，從而促進AS的發(fā)生發(fā)展。本研究通過加入Hcy培養(yǎng)VSMCs，以探討eNOS、CAV1和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路在Hcy促進大鼠VSMCs遷移、增殖中的作用，以期為AS的治療研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 2016年1—6月選取SPF級SD大鼠6只，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，雄性，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物健康狀況良好，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%，晝夜照明12 h/12 h。Hcy、四唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、抗PI3K抗體購自美國Sigma公司，抗eNOS單克隆抗體、抗CAV1多克隆抗體購自美國Introgen Therapeutics公司，抗p-Akt抗體購自美國Bioworld公司，Western blotting試劑盒購自南京碧波生物科技有限公司，一氧化氮(NO)測試盒(硝酸還原酶法)購自南京建成生物工程研究所，DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司。

1.2 SD大鼠VSMCs分離、培養(yǎng) 采用隨機抽樣法將SD大鼠分為3批，每批2只，每批飼養(yǎng)1周后處死，所有實驗重復(fù)3次。每批實驗采用頸椎脫臼法處死2只SD大鼠，打開胸腔找出胸主動脈；分離血管周圍結(jié)締組織，縱向剪開血管，刮除內(nèi)膜，取出中膜；將中膜加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，并剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，此后每3 d換液，直至細胞融合度為80%～90%時進行傳代。每隔3～4 d 傳代1次。取4～7代細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液并計數(shù)，按6×103個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細胞同步化[9]。將同步化后的細胞平均分為3份，分別進行1.3、1.4、1.5的實驗。

1.3 Transwell法檢測VSMCs遷移能力 取其中1份同步化后的細胞中加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細胞增殖后加入0.25%胰蛋白酶消化。將消化后的細胞平均分為4份，分別用含不同濃度Hcy(濃度分別為0、100、200、500 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液(無FBS)，分別為空白對照組、100 μmol/L Hcy組、200 μmol/L Hcy組、500 μmol/L Hcy組，調(diào)整細胞濃度為3×104個細胞/ml。在Transwell小室(0.8 μm)上室加入200 μl細胞懸液，下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl，培養(yǎng)48 h。結(jié)束后取出上室，用棉簽輕輕擦上室內(nèi)側(cè)壁，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，多聚甲醛固定，蘇木素、伊紅染色，PBS沖洗后，顯微鏡下每組隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.4 MTT法檢測VSMCs增殖 另取1份同步化后的細胞分別加入不同濃度的Hcy(濃度分別為0、100、200、500 μmol/L)，分別為空白對照組、100 μmol/L Hcy組、200 μmol/L Hcy組、500 μmol/L Hcy組，4組細胞每組均分為3份，均在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組3份細胞分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h，后分別加入MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶標儀檢測各孔490 nm處光密度(OD)值。細胞加入MTT培養(yǎng)檢測后不復(fù)用。

1.5 NO的檢測 取最后一份同步化后的細胞分別加入相應(yīng)濃度的Hcy(濃度分別為0、100、200、500 μmol/L)，分別為空白對照組、100 μmol/L Hcy組、200 μmol/L Hcy組、500 μmol/L Hcy組，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h。150×g離心5 min后，吸取細胞培養(yǎng)上清液，按照NO測試盒(硝酸還原酶法)說明書測定NO濃度。

1.6 Western blotting檢測 1.5中細胞離心后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，根據(jù)Western blotting試劑盒的說明書進行eNOS、CAV1、PI3K、p-Akt蛋白的測定，蛋白條帶采用Image Lab軟件自動分析。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對VSMCs遷移的影響 12 h、24 h、48 h時各組VSMCs穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為3.097、4.152、5.590，P<0.05)。12 h、24 h、48 h時Hcy干預(yù)的各組 VSMCs穿膜細胞數(shù)多于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。VSMCs穿膜細胞數(shù)與Hcy濃度呈正相關(guān)(r=0.582,P=0.020)。

表1 各組VSMCs穿膜細胞數(shù)比較(n=15)

注：Hcy=同型半胱氨酸；與空白對照組比較，aP<0.05

2.2 Hcy對VSMCs增殖的影響 12 h時，4組OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.265,P=0.295)。24 h時，4組OD值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.239,P=0.022)；Hcy干預(yù)的各組OD值均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；500 μmol/L Hcy組OD值高于100 μmol/L Hcy組、200 μmol/L Hcy組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。48 h時，4組OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.237,P=0.009)；Hcy干預(yù)的各組OD值高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。OD值與Hcy濃度呈正相關(guān)(r=0.620,P=0.015)。

2.3 VSMCs釋放NO情況和VSMCs eNOS蛋白表達水平 各組VSMCs釋放NO比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.348，P<0.05)。Hcy干預(yù)的各組VSMCs釋放NO低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。NO與Hcy濃度呈負相關(guān)(r=-0.479，P=0.028)。各組eNOS蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.204，P<0.05)。Hcy干預(yù)的各組eNOS蛋白表達水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖1)。eNOS蛋白表達水平與Hcy濃度呈負相關(guān)(r=-0.544，P=0.033)。NO與eNOS蛋白表達水平呈正相關(guān)(r=0.721，P=0.009)。

表2 各組VSMCs增殖情況(OD值，n=15)

注：VSMCs=血管平滑肌細胞；與空白對照組比較，aP<0.05；與100 μmol/L Hcy組比較，bP<0.05；與200 μmol/L Hcy組比較，cP<0.05

表3 各組VSMCs釋放NO情況(n=15，μmol/L)

注：NO=一氧化氮；與空白對照組比較，aP<0.05

表4 各組VSMCs eNOS、CAV1、PI3K、p-Akt蛋白表達水平(n=15)

Table 4 Protein eNOS,CAV1,PI3K and p-Akt expression of different groups

組別eNOSCAV1PI3Kp-Akt空白對照組0.63±0.280.11±0.090.08±0.100.05±0.06100μmol/LHcy組0.49±0.24a0.16±0.10a0.12±0.08a0.14±0.07a200μmol/LHcy組0.32±0.21ab0.30±0.17ab0.15±0.09a0.27±0.15ab500μmol/LHcy組0.24±0.18ab0.38±0.16abc0.20±0.13ab0.31±0.11ab

注：eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶，CAV1=小凹蛋白-1，PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，p-Akt=磷脂酰肌酶-蛋白激酶；與空白對照組比較，aP<0.05；與100 μmol/L Hcy組比較，bP<0.05；與200 μmol/L Hcy組比較，cP<0.05

注：eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶,Hcy=同型半胱氨酸；A為空白對照組,B為100 μmol/L Hcy組,C為200 μmol/L Hcy組,D為500 μmol/L Hcy組

圖1 各組VSMCs eNOS蛋白表達

Figure 1 eNOS expression in VSMCs cultured in different groups

2.4 VSMCs CAV1蛋白表達水平 各組VSMCs CAV1蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.233，P<0.05)。Hcy干預(yù)的各組VSMCs CAV1蛋白表達水平均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖2)。CAV1蛋白表達水平與Hcy濃度呈正相關(guān)(r=0.505,P=0.042)。

2.5 VSMCs PI3K、p-Akt蛋白表達 各組VSMCs PI3K、p-Akt蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為2.878、3.799，P<0.05)。Hcy干預(yù)的各組VSMCs PI3K、p-Akt蛋白表達水平均較空白對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖3)。PI3K(r=0.428，P=0.030)、p-Akt(r=0.389，P=0.047)蛋白表達與Hcy濃度均呈正相關(guān)。

注：CAV1=小凹蛋白-1；A為空白對照組，B為100 μmol/L Hcy組，C為200 μmol/L Hcy組，D為500 μmol/L Hcy組

圖2 各組VSMCs CAV1蛋白表達

Figure 2 CAV1 expression in VSMCs cultured in different groups

注：PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，p-Akt=磷脂酰肌酶-蛋白激酶；A為空白對照組，B為100 μmol/L Hcy組，C為200 μmol/L Hcy組，D為500 μmol/L Hcy組

圖3 各組VSMCs PI3K、p-Akt信號通路蛋白表達

Figure 3 PI3K expression in VSMCs cultured in different groups

3 討論

VSMCs位于動脈血管中層，主要發(fā)揮收縮血管的作用，Hcy作為心血管疾病的獨立危險因素，可通過損傷血管內(nèi)皮細胞、促進黏附分子和趨化因子等炎性因子的合成分泌，進而促進VSMCs向內(nèi)膜下遷移和增殖[10]。同時，VSMCs通過吞噬氧化低密度脂蛋白，成為肌源性泡沫細胞，進一步分泌大量的炎性因子，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)降解，最終導(dǎo)致動脈粥樣斑塊的形成和破裂。已有研究認為，Hcy對eNOS活性和NO釋放的抑制作用可能是其促進VSMCs遷移、增殖的原因之一[5-6]。CAV1作為eNOS的負性調(diào)節(jié)因子，是細胞質(zhì)膜上小凹結(jié)構(gòu)的重要結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，其可與多種細胞蛋白分子結(jié)合，啟動下游信號，是調(diào)節(jié)細胞信號的關(guān)鍵步驟，在VSMCs的遷移、增殖過程中具有重要作用[11]。而PI3K/Akt是參與AS發(fā)生發(fā)展的重要信號通路，參與了平滑肌細胞的增殖、分化、凋亡過程[12-13]。因此，本研究通過在體外培養(yǎng)大鼠的VSMCs，以探討Hcy誘導(dǎo)VSMCs遷移、增殖的作用機制，以及eNOS、CAV1和PI3K/Akt信號通路在其中的作用。

本研究結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)的各組VSMCs穿膜細胞數(shù)、OD值均高于空白對照組，從而再次證實了Hcy對VSMCs遷移和增殖的促進作用。同時，研究結(jié)果顯示VSMCs穿膜細胞數(shù)、OD值與Hcy濃度呈正相關(guān)，這提示Hcy對VSMCs遷移和增殖的促進作用具有劑量依賴性。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可增強CAV1蛋白表達，CAV1可能通過其骨架結(jié)構(gòu)中的相關(guān)氨基酸殘基，以蛋白-蛋白相結(jié)合的形式結(jié)合酪氨酸磷酸化形式的eNOS，形成復(fù)合物，進而抑制eNOS活性[14]。本研究結(jié)果提示，Hcy干預(yù)的各組VSMCs CAV1蛋白表達水平均較空白對照組升高，而eNOS蛋白表達水平下降。并且隨Hcy濃度上升，CAV1蛋白表達水平升高，eNOS蛋白表達水平降低。eNOS為促進NO合成釋放的關(guān)鍵酶，本研究結(jié)果顯示，隨著eNOS蛋白表達水平降低，NO亦出現(xiàn)下降，結(jié)合Hcy呈劑量依賴性促進VSMCs增殖、遷移的研究結(jié)果提示，在VSMCs中，Hcy可通過誘導(dǎo)CAV1蛋白表達，降低eNOS活性，抑制NO生成，從而促進細胞增殖、遷移。

PI3K可被多種細胞外信號分子激活，繼而使其下游靶分子Akt磷酸化形成p-Akt，p-Akt可調(diào)控抗凋亡蛋白基因的表達或通過信號偶聯(lián)促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，是AS發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)途徑[12-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可通過增強PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵蛋白和分子的表達，從而誘導(dǎo)人主動脈平滑肌細胞遷移、增生[15]。CARREIRA等[16]發(fā)現(xiàn)高濃度外源性NO可抑制細胞增殖，而TORROGLOSA等[17]研究顯示NO此種抑制細胞增殖的作用是通過激活PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。而國內(nèi)劉淼青等[18]的研究表明，NO可通過抑制PI3K/Akt信號通路，發(fā)揮抑制腸神經(jīng)干細胞增殖的作用。在本研究中，NO與Hcy濃度呈負相關(guān)，PI3K、p-Akt蛋白表達與Hcy濃度呈正相關(guān)，這提示NO減少導(dǎo)致了PI3K/Akt信號通路的活化?？紤]可能為NO對PI3K/Akt信號通路的抑制作用減弱，導(dǎo)致其抗平滑肌增殖的能力減弱，從而促進了Hcy對VSMCs增殖、遷移的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，Hcy參與AS的機制，可能與Hcy誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)CAV1蛋白高表達、降低eNOS活性、抑制NO釋放并活化PI3K/Akt信號通路，從而促進VSMCs遷移、增殖相關(guān)。由于目前關(guān)于CAV1在Hcy參與AS形成和發(fā)展中的作用研究仍然較少，本研究在此方面進行了相關(guān)探究，為日后的研究提供了一定的研究依據(jù)和基礎(chǔ)。但是，本研究僅取用大鼠主動脈的VSMCs，對于不同種屬和部位，Hcy對VSMCs的具體作用情況是否相同，目前仍未可知；其次，本研究在Hcy干預(yù)下采用直接檢測相關(guān)生物標志物的方法進行研究，并未采用更多的阻斷、增強表達等途徑進一步驗證和對比。以上的不足之處仍需通過更多、更深入的實驗進一步探討。

作者貢獻：紀昕負責課題構(gòu)思、實驗設(shè)計、論文撰寫；王鑫負責研究的設(shè)計與實施、結(jié)果分析；岳曉樂、趙丹丹、郭玉楷進行實驗實施、評估統(tǒng)計、資料收集；李永軍負責指導(dǎo)課題設(shè)計、組織課題實施、論文修訂審校、整體質(zhì)量控制和監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔莎)

Effects of eNOS,CAV1 and PI3K/Akt Signaling Pathway in Homocystein Promoting Rat Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Proliferation

JIXin,WANGXin,YUEXiao-le,ZHAODan-dan,GUOYu-kai,LIYong-jun*

ClinicalLaboratory,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000，China

*Correspondingauthor:LIYong-jun,Chieflaboratorian,Mastersupervisor;E-mail：lyjj221@sina.com

Objective To explore the effects of endothelial nitric oxide synthase(eNOS),caveolae-1(CAV1) and phosphatidylinositol3-kinase /protein kinase B(PI3K/Akt) signaling pathway in homocystein(Hcy) promoting rat vascular smooth muscle cells(VSMCs) migration and proliferation.Methods Between January and June 2016 VSMCs were isolated from the thoracic aorta media of the SPF grade SD rats and subcultured by substrate-attached explant method,and by which 4-7 generations of VSMCs were obtained.Four groups were set and given 0(blank control group),100,200 and 500 μmol/L Hcy group,respectively to culture the VSMCs.Transwell assay was used to detect VSMCs migration,while the conditions of VSMCs proliferation were examined by MTT assay.Nitric oxide(NO) concentration in VSMCs culture supernatant fluid was examined by nitrate reductase test,and the expressions of eNOS,CAV1,PI3K and p-Akt in VSMCs were detected by Western blotting.Results The numbers of VSMCs permeating the septum were significantly positively correlated with Hcy concentrations(r=0.582,P=0.020).The MTT assay showed that positive correlations were found between OD values and Hcy concentrations(r=0.620,P=0.015).NO concentrations of 100,200 and 500 μmol/L Hcy groups were all lower than those of the blank control group(P<0.05).Hcy concentrations were negatively associated with NO concentrations(r=-0.479，P=0.028) as well as eNOS expressions(r=-0.544,P=0.033).NO concentrations were positively correlated with eNOS expressions(r=0.721，P=0.009).Expressions of CAV1,PI3K and p-Akt in VSMCs cultured in 100,200 as well as 500 μmol/L Hcy groups were all higher than those in the blank control group(P<0.05).Hcy concentrations showed positive correlation with CAV1 expressions(r=0.505,P=0.042),PI3K expressions(r=0.428，P=0.030),and p-Akt expressions(r=0.389，P=0.047).Conclusion Hcy may induce VSMCs migration and proliferation through promoting the CAV1 expression,inhibiting the activity of eNOS and release of NO,and activating the PI3K/Akt signaling pathway,thereby,the atherosclerosis is developed.

Cysteine;Myocytes,smooth muscle;Nitric oxide synthase;Caveolae;Phosphoinositide 3-kinase

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)2014AA022304子課題；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計劃(20130466)

R 341.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.012

2016-10-25；

2017-02-10)

050000河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科

*通信作者：李永軍，主任檢驗師，碩士生導(dǎo)師；E-mail：lyjj221@sina.com