陳聚伍，謝 冕，任 佳，孟 宇

·臨床診療提示·

微小RNA-124在急性脊柱創(chuàng)傷所致急性脊髓損傷中的診斷價值

陳聚伍*，謝 冕，任 佳，孟 宇

目的 探討微小RNA-124(miR-124)對急性脊柱創(chuàng)傷所致急性脊髓損傷的診斷價值。方法 選取2014年9月—2015年9月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院急診入院的45例急性脊柱創(chuàng)傷患者，并按照脊髓損傷神經(jīng)學分類國際標準中的美國脊髓損傷協(xié)會殘損分級(AISA分級)將患者分為脊髓完全損傷組(AISA分級A級)15例、脊髓不完全損傷組(AISA分級B、C、D級)15例、神經(jīng)功能正常組(AISA分級E級)15例，另選取同期入院的急性四肢創(chuàng)傷患者15例為對照組。抽取各組患者創(chuàng)傷后24 h內外周靜脈血并對其血漿miR-124水平及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平進行測定。結果 各組間miR-124、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脊髓完全損傷組、脊髓不完全損傷組的miR-124、TNF-α水平均高于神經(jīng)功能正常組與對照組(P<0.05)?；颊邉?chuàng)傷后24 h外周靜脈血miR-124、TNF-α診斷急性脊髓損傷的受試者工作特征(ROC)曲線下面積分別為0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕、0.770〔95%CI(0.641，0.879)〕。結論 miR-124診斷急性脊髓損傷的特異度要優(yōu)于TNF-α，今后可將miR-124作為診斷急性脊柱創(chuàng)傷后急性脊髓損傷的潛在檢測標志物。

脊柱損傷；脊髓損傷；診斷；腫瘤壞死因子-α；微小RNA-124

陳聚伍，謝 冕，任 佳，等.微小RNA-124在急性脊柱創(chuàng)傷所致急性脊髓損傷中的診斷價值[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(12)：1506-1510.[www.chinagp.net]

CHEN J W,XIE M,REN J，et al.Diagnostic value of miR-124 in acute spinal cord injury caused by acute spinal trauma[J].Chinese General Practice，2017，20(12)：1506-1510.

急性脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種由高能量損傷引起的病死率高、并發(fā)癥多、致殘率高、預后差的疾病[1]?；颊叨喟橛薪K身軀體功能障礙，給社會及其家庭帶來極大負擔和痛苦[2]。隨著經(jīng)濟發(fā)展，由車禍傷、墜落傷引起的急性SCI的救治，日益成為創(chuàng)傷外科面臨的難題。

微小RNA(miR)是一類由21～25個核苷酸組成的內源性表達的單鏈非編碼小RNA,通過抑制靶mRNA翻譯或促使其降解對基因表達起調控作用[3]。微小RNA-124(miR-124)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達水平特異性升高，但在其他組織中尚未發(fā)現(xiàn)這種特性[4]。近年來，通過外周靜脈血標志物監(jiān)測中樞神經(jīng)的早期病變或預測重度中樞神經(jīng)病變的預后受到更多研究者的重視[5-6]。有研究顯示，神經(jīng)組織及外周靜脈血腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平與脊髓損傷相關[7]。動物研究證實當中樞神經(jīng)受損時，外周靜脈血中的miR-124水平會發(fā)生變化[8]。本研究旨在探討miR-124對急性脊柱創(chuàng)傷所致急性SCI的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 納入標準及排除標準 納入標準：(1)急性SCI患者符合2013美國神經(jīng)外科醫(yī)師大會(CNS)和美國神經(jīng)外科醫(yī)師協(xié)會(AANS)發(fā)布的急性脊髓損傷管理指南中的相關診斷標準[9]，急性四肢創(chuàng)傷患者有明確的影像學診斷；(2)患者創(chuàng)傷發(fā)生時間距入院時間均在24 h內；(3)患者年齡≥18周歲。排除標準：(1)半年內有脊髓及顱腦相關創(chuàng)傷及手術史者；(2)存在大面積心肌梗死或急性冠脈綜合征、嚴重心律失常、急性呼吸窘迫綜合征等嚴重心肺疾病者；(3)急性嚴重顱腦損傷(嚴重腦創(chuàng)傷、大量腦出血、大面積腦梗死、嚴重腦干損傷等)者；(4)孕婦；(5)既往有急性SCI、顱腦損傷史者；(6)伴有惡性腫瘤、急慢性感染、嚴重肝腎功能不全、腦血管疾病、自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究對象 回顧性分析2014年9月—2015年9月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院急診入院且診斷明確的急性脊柱創(chuàng)傷患者的臨床資料。最終確定符合納入標準且資料完整的急性SCI患者共45例，其中頸椎骨折27例、截癱26例、四肢癱瘓19例、胸腰椎骨折18例。按照SCI神經(jīng)學分類國際標準中的美國脊髓損傷協(xié)會殘損分級(AISA分級)[10]將患者分為脊髓完全損傷組(AISA分級A級)15例、脊髓不完全損傷組(AISA分級B、C、D級)15例、神經(jīng)功能正常組(AISA分級E級)15例；另選取同期入院的急性四肢創(chuàng)傷患者15例為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會審查通過，符合醫(yī)學倫理學標準，并獲得患者或其代理人同意。

1.3 主要試劑及儀器 TNF-α放射免疫檢測試劑盒：北京北雅免疫生物技術研究所；RNA提取試劑：美國MRC公司-TRI Reagent BD；實時災光定量PCR試劑盒及反轉錄試劑盒：TaKaRa公司；γ計數(shù)器：德國PerkinElmer公司；PCR儀：美國ABI公司；ND2000C紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科

本文創(chuàng)新點/不足：

(1)既往的脊髓損傷動物模型多測定脊髓組織中微小RNA-124(miR-124)水平的遠期改變，很少關注急性期改變，無論是在相關動物實驗還是臨床研究中，均少有涉及。(2)本研究的觀察對象相對較少，入組患者創(chuàng)傷的類型并不十分全面，與急性脊柱創(chuàng)傷的疾病譜有一定差異，這和創(chuàng)傷性疾病的分級救治與轉運規(guī)律有一定關系。

技公司。

1.4 標本采集 患者入院后(創(chuàng)傷發(fā)生后24 h內)采集外周靜脈血約4 ml，置于EDTA-K2抗凝管，在4 ℃條件下保存。

1.5 血漿miR-124水平測定 采用實時熒光定量PCR技術測定血漿miR-124水平，外周靜脈血標本在3 000×g條件下離心10 min，取得血漿并轉至1.5 ml EP管中，在12 000×g條件下再次離心10 min后取200 μl血漿，用RNA提取試劑提取總RNA。ND2000C 紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。取A260/A280為1.8～2.1 的樣品用于下一步實驗；嚴格按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。由廣州市銳博生物科技有限公司完成引物的設計與合成。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火、延伸30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，1個循環(huán)繪制溶解曲線。內參基因：U6。血漿miR-124水平用2-ΔΔCt法計算[11]。

1.6 血清 TNF-α水平測定 采用放射免疫法測定血清TNF-α水平，嚴格按試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 各組性別、年齡、身高、體質量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組入院體溫比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 各組外周靜脈血miR-124、TNF-α水平比較 各組miR-124、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脊髓完全損傷組、脊髓不完全損傷組miR-124、TNF-α水平均高于神經(jīng)功能正常組與對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 外周靜脈血miR-124與TNF-α對急性SCI的診斷價值 外周靜脈血miR-124與TNF-α診斷急性SCI的AUC分別為0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕及0.770〔95%CI(0.641，0.879)，見表3、圖1〕。

表1 各組一般資料比較

Table 1 General data of complete SCI,incomplete SCI,normal nerve function and control groups

組別例數(shù)性別(男/女)年齡(x±s,歲)身高(x±s,m)體質量(x±s,kg)入院體溫(x±s,℃)對照組159/643.5±10.51.7±0.164.3±7.336.8±0.4脊髓完全損傷組159/645.9±10.81.7±0.162.8±9.437.6±0.8脊髓不完全損傷組1510/544.5±10.61.7±0.163.6±9.237.4±0.5神經(jīng)功能正常組1510/547.1±11.61.7±0.164.5±6.837.2±0.6F(χ2)值0.29a0.31-0.200.135.07P值0.960.820.890.94<0.05

注：a為χ2值

Table 2 miR-124 and TNF-α levels in peripheral venous blood in complete SCI,incomplete SCI,normal nerve function and control groups

組別例數(shù)miR-124TNF-α(μg/L)對照組150.34±0.041.69±0.19脊髓完全損傷組150.48±0.06a1.97±0.22a脊髓不完全損傷組150.47±0.07a1.85±0.43a神經(jīng)功能正常組150.39±0.07bc1.78±0.21bcF值27.283.51P值<0.01<0.05

注：miR-124=微小RNA-124，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與對照組比較，aP<0.05； 與脊髓完全損傷組比較，bP<0.05；與脊髓不完全損傷組比較，cP<0.05

表3 外周靜脈血miR-124、TNF-α對急性SCI的診斷價值

Table 3 Value of miR-124 and TNF-α in peripheral venous blood for the diagnosis of acute SCI

指標截斷值靈敏度(%)特異度(%)約登指數(shù)陽性預測值(%)陰性預測值(%)miR-1240.459a90.090.00.80090.090.0TNF-α1.82576.780.00.56779.377.4

注：a為相對表達水平

3 討論

急性SCI作為患者長期預后及生存質量最差的骨科急癥之一[12]，極易造成家庭巨大的醫(yī)療支出。判斷急性脊柱創(chuàng)傷是否伴發(fā)急性SCI主要通過病史的采集和相關體格檢查，精神狀態(tài)較好的成年患者可以告知醫(yī)師主訴并且配合其完成體格檢查，但是由于疼痛、驚嚇、休克等原因造成不能早期判斷患者SCI情況[13]。一旦發(fā)生急性SCI，易引起神經(jīng)組織內鏈式的炎性反應，伴隨有大量炎性細胞與炎性遞質的滲出及浸潤，再加之骨折端的物理刺激、血腫壓迫等原因導致患者病情在早期常會出現(xiàn)進行性加重，損傷發(fā)生超過24 h，再行手術和藥物治療將喪失最佳治療時機[14]。臨床上也使用體感誘發(fā)電位和MRI獲取患者急性SCI的客觀信息，但面臨軀體多次搬運、設備及人員的完備率、脫離高級生命支持狀態(tài)下時間過長、患者本人主客觀條件不配合(如疼痛、創(chuàng)傷后精神障礙)等諸多難以解決的問題。而此時實驗室診斷則排除了上述主客觀因素的干擾，在避免漏診、縮短確診時間、治療方案的制定和手術時機的把握等方面體現(xiàn)出較大輔助作用。外周靜脈血是臨床上最常用的標本類型，以往的研究中多使用外周靜脈血中前列腺素等炎性因子，核因子κB(NF-κB)等細胞轉導通路的標志物，半胱氨酸蛋白酶32等調控蛋白作為急性SCI的相關判定指標[15-17]。TNF-α最早是作為一種具有殺傷腫瘤作用的物質被發(fā)現(xiàn)，已有研究認為TNF-α在中樞神經(jīng)組織的損傷中具有指示作用[18]，也有研究者對白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)在急性SCI診斷方面進行了研究[19]，但是這些指標在炎性疾病、腫瘤性疾病中均有特征性表現(xiàn)，單純通過病史并不能確定患者體內的相關因子變化有單一的中樞神經(jīng)損傷來源。miR-124是最早被證實在成年哺乳動物的腦和脊髓神經(jīng)元中大量表達的miR分子之一，近年來其在中樞神經(jīng)損傷方面的臨床研究逐漸深入。以往學者發(fā)現(xiàn)miR-124在腦缺血、癲癇、帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生中起著較為重要的作用[20-22]。近年來不斷有實驗證實miR-124在小鼠等哺乳動物急性SCI后的繼發(fā)性神經(jīng)損傷過程中有十分重要的作用[23]，并且其在急性SCI的干細胞治療領域的靶向指導作用也受到重視[24]，給急性SCI組織的修復與再生研究提供了重要的靶點和監(jiān)測指標[25]。

注：miR-124=微小RNA-124，TNF-α=腫瘤壞死因子α

圖1 外周靜脈血miR-124與TNF-α診斷急性SCI的ROC曲線

Figure 1 ROC curve for miR-124 and TNF-α in peripheral venous blood for the diagnosis of acute SCI

本研究結果顯示，脊髓完全、不完全損傷組患者創(chuàng)傷后24 h內外周靜脈血miR-124、TNF-α水平均高于神經(jīng)功能正常組與對照組，說明上述兩指標對于急性脊柱創(chuàng)傷患者急性SCI的診斷均有指導意義，其中miR-124診斷急性SCI的特異度(90.0%)和靈敏度(90.0%)均高于TNF-α(特異度80.0%，靈敏度76.7%)?；颊邆?4 h內外周靜脈血miR-124診斷急性SCI的AUC(0.948)大于TNF-α(0.770)，miR-124相較于TNF-α更適合協(xié)助診斷急性SCI。將來在面對有疑似急性脊柱創(chuàng)傷病史的患者時，醫(yī)生在24 h內抽取外周靜脈血，測定miR-124水平，就能篩選出急性SCI患者，進而進行積極手術/藥物治療，以改善預后、減少致殘的發(fā)生。

綜上所述，miR-124診斷急性SCI的特異度明顯優(yōu)于TNF-α，能夠在創(chuàng)傷發(fā)生的急性期(24 h內)鑒別出急性SCI患者，有利于急性SCI急診手術的開展。未來可將miR-124作為診斷急性脊柱創(chuàng)傷后急性SCI的潛在檢測標志物。

作者貢獻：陳聚伍負責試驗設計，撰寫論文并對文章負責；謝冕負責課題實施，試驗數(shù)據(jù)、資料收集，統(tǒng)計分析，文章審校；任佳、孟宇負責標本采集和臨床資料整理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔莎)

Diagnostic Value of miR-124 in Acute Spinal Cord Injury Caused by Acute Spinal Trauma

CHENJu-wu*,XIEMian,RENJia，MENGYu

EmergencyMedicineDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

*Correspondingauthor:CHENJu-wu,Professor;E-mail:feiyangdabeiyao@yahoo.com

Objective To investigate the diagnostic value of microRNA-124(miR-124) in acute spinal cord injury(SCI) caused by acute spinal trauma.Methods The subjects enrolled in this study were 45 patients with acute spinal trauma and 15 patients with acute limb trauma admitted to Emergency Medicine Department of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from September 2014 to September 2015.In accordance with the SCI level evaluated by American Spinal Injury Association(ASIA) Impairment Scale in International Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injury,the patients with acute spinal trauma were divided into complete SCI group(ASIA grade A,n=15) and incomplete SCI group(ASIA grade B,C,D,n=15),normal nerve function group(ASIA grade E,n=15).The patients with acute limb fracture were set as the control group.Peripheral venous blood was taken from the patients in each group within 24 hours after injury and the levels of plasma miR-124 and serum tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) were measured.Results Significant differences in miR-124 as well as in TNF-α levels were found between the groups(P<0.05).Levels of both miR-124 and TNF-α were higher in the complete SCI group than in normal nerve function group and control group(P<0.05).Incomplete SCI group had higher levels of both miR-124 and TNF-α than the normal nerve function group and control group(P<0.05).The area under the curve(AUC) of receiver operating characteristic(ROC) of miR-124,TNF-α at 24h after injury for diagnosing acute SCI was 0.948〔95%CI(0.890，1.000)〕,0.770〔95%CI(0.641，0.879)〕 respectively.Conclusion The specificity of miR-124 for the diagnosis of acute SCI due to spinal trauma is better than that of TNF-α.Therefore,in the future,miR-124 can be used as a potential marker for the diagnosis of the disease.

Spinal injuries;Spinal cord injuries;Diagnosis;Tumor necrosis factor-alpha;miR-124

國家臨床重點?？平ㄔO項目(2012-649)

R 826.64

B

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.019

2016-11-19；

2017-02-08)

450052河南省鄭州市，鄭州大學第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學部

*通信作者：陳聚伍，教授；E-mail:feiyangdabeiyao@yahoo.com