王 琰， 徐瑞榮， 王 舟， 楊 真， 崔思遠(yuǎn)， 張 杰

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液科， 山東 濟(jì)南 250014)

再生障礙性貧血患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度及P53、P21的表達(dá)*

王 琰， 徐瑞榮△， 王 舟， 楊 真， 崔思遠(yuǎn)， 張 杰

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血液科， 山東 濟(jì)南 250014)

目的： 研究再生障礙性貧血(AA)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)的端粒長(zhǎng)度以及P53和P21表達(dá)水平，探討它們與AA 發(fā)病的關(guān)系。方法: 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)60例 AA患者[其中非重型再障(NSAA)38例，重型再障(SAA)22例]和25例對(duì)照者BMMNC中端粒長(zhǎng)度以及P53和P21的mRNA表達(dá)情況；采用Western blot法檢測(cè)P53和P21蛋白表達(dá)情況；并進(jìn)行相關(guān)性比較。骨髓活檢術(shù)檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞成分分布情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比情況。結(jié)果: AA患者端粒長(zhǎng)度較對(duì)照組明顯縮短，骨髓造血細(xì)胞成分及CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)；NSAA、SAA患者與對(duì)照組相比端粒長(zhǎng)度均明顯縮短，骨髓造血細(xì)胞成分及CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比均明顯減少(P<0.05)；SAA與NSAA比較，端粒長(zhǎng)度明顯縮短，骨髓造血細(xì)胞成分及CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比明顯減少(P<0.05)。AA患者P53和P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；NSAA和SAA患者P53和P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯升高(P<0.05)；SAA患者P53和P21的mRNA及蛋白表達(dá)水平較NSAA明顯升高(P<0.05)。端粒長(zhǎng)度與P53表達(dá)水平或P21表達(dá)水平之間沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)；P53表達(dá)水平與P21表達(dá)水平之間呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: 端粒長(zhǎng)度的改變以及P53和P21可能參與了再障的發(fā)病經(jīng)過(guò)，推測(cè)可能是通過(guò)抑制造血干細(xì)胞的增殖和分化，從而引發(fā)造血細(xì)胞凋亡。

端粒長(zhǎng)度； P53； P21； 再生障礙性貧血

再生障礙性貧血(aplastic anemia, AA)簡(jiǎn)稱再障，是血液病中常見(jiàn)的骨髓衰竭性疾病。再障主要病變部位在骨髓，其發(fā)病機(jī)制主要有造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量或者功能缺陷、免疫異常及造血微環(huán)境障礙等。近年有研究發(fā)現(xiàn)，端粒、端粒酶以及端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)異常也可能是導(dǎo)致再障發(fā)病的重要因素之一，對(duì)再障的發(fā)生發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)化都有一定的影響。大約有33%的再障患者存在白細(xì)胞端?？s短現(xiàn)象[1]。這部分患者對(duì)免疫抑制劑的治療反應(yīng)較差。研究顯示，白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度可作為再障惡性克隆發(fā)展重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)，端粒縮短與疾病病程無(wú)相關(guān)性，與復(fù)發(fā)及死亡率有關(guān)，提示端粒長(zhǎng)度的縮短與再障的發(fā)病有關(guān)，可能反映了造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)造血功能的缺陷[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞的凋亡與衰老與DNA損傷及線粒體的代謝調(diào)控等有密切關(guān)系，干細(xì)胞功能下降的主要核心因素是與細(xì)胞凋亡、衰老相關(guān)的端粒損傷和端?！懊薄惫δ芩ネ税殡SP53的激活[3]。激活的P53可以作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)誘導(dǎo)多種基因(包括p21基因)的轉(zhuǎn)錄。P21可防止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞周期停止，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。端粒損傷以及端粒功能障礙，可激活P53介導(dǎo)的DNA損傷信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)P21表達(dá)，致細(xì)胞增殖阻滯、凋亡、衰老，進(jìn)而影響干細(xì)胞造血功能。我們擬通過(guò)觀察再障患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNC)的端粒長(zhǎng)度以及P53、P21的表達(dá)水平，并結(jié)合再障患者骨髓造血細(xì)胞成分分布情況及CD34+細(xì)胞占比情況，來(lái)分析其可能的作用機(jī)制，為探析再障的發(fā)病機(jī)制提供可能的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為治療再障尋找可能的作用靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

收集2014年3月～2016年3月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院就診的住院及門(mén)診再障患者60例，其中男性 39例，女性 21例，中位年齡為38(15～66)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)。其中非重型再障(non-severe aplastic anemia，NSAA)38例，重型再障(severe aplastic anemia, SAA)22例。另外選取健康志愿者25例作為對(duì)照，其中男性15例，女性10例，中位年齡為37(18～65)歲。3組在年齡方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異，具有可比性。

2 主要試劑和儀器

淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆籘RIzol試劑購(gòu)自Invitrogen；SYBR Green試劑盒(SuperReal)和FastQuant RT (With gDNase)試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA/RNA/蛋白共提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega；β-actin抗體(上?？党缮?；P53抗體(CST)；P21抗體(Abcam)；HRP標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(Jackson)；ECL化學(xué)發(fā)光液、顯影液和定影液(碧云天生物科技有限公司)；蛋白預(yù)染Marker(Fermentas)；CD45-PerCP、CD34-FITC、CD38-PE、CD117-APC、HLA-DR-APC等及陰性對(duì)照(BD)。Prism 7000 PCR擴(kuò)增儀為 ABI 產(chǎn)品。FACSCanto Ⅱ 流式細(xì)胞儀為BD產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 BMMNC的分離及DNA、RNA和蛋白的制備 采集新鮮骨髓4 mL，EDTA抗凝。經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離BMMNC，用DNA/RNA/蛋白共提取試劑盒分別抽提DNA、RNA和蛋白，具體按試劑說(shuō)明書(shū)中操作步驟進(jìn)行。凝膠電泳鑒定后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA和RNA的質(zhì)量和濃度。置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白樣品變性完畢后冷卻，瞬時(shí)離心，于-20 ℃保存。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)端粒長(zhǎng)度及P53和P21的mRNA表達(dá) 引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。按RT-PCR試劑盒提供方法進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后行PCR。端粒及端粒內(nèi)參照36B4反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。P53、P21以及內(nèi)參照GAPDH反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，每次擴(kuò)增均設(shè)立內(nèi)參照和無(wú)模板陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后作熔解曲線分析以鑒定產(chǎn)物是否單一。結(jié)果采用 2-ΔΔCt法表示。其中，端粒長(zhǎng)度根據(jù)T/S比率來(lái)測(cè)定，T/S比率同端粒長(zhǎng)度呈正比，相對(duì)端粒長(zhǎng)度可以采用相對(duì)T/S表示。

表1 RT-qPCR引物序列

3.3 Western blot檢測(cè)P53和P21的蛋白表達(dá) BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣 50 μg 蛋白樣品，依次經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜并封閉，加Ⅰ抗(P53 1∶750,P21 1∶1 000)孵育后再加入Ⅱ抗孵育。最后加入熒光檢測(cè)試劑，UVP 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

3.4 骨髓活檢病理學(xué)分析 骨髓活檢組織均采自髂后上棘，取骨髓組織1條，長(zhǎng)約0.8～1.2 cm，直徑0.2 cm，4%甲醛中性固定液固定，石蠟切片，做蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色、網(wǎng)織纖維染色和鐵染色，光鏡下觀察。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓CD34+細(xì)胞占比 采集新鮮骨髓 3 mL，EDTA抗凝，24 h內(nèi)檢測(cè)。收集1×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)冷的PBS 洗滌細(xì)胞，800 r/min離心5 min，4%多聚甲醛1 mL室溫固定，PBS 重懸細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸浮液，加入熒光標(biāo)記抗體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值，每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，樣本的相關(guān)性分析采用 Spearman檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 再生障礙性貧血患者端粒長(zhǎng)度變化情況

端粒及端粒內(nèi)參照36B4的熔解曲線均呈單一峰，無(wú)其它雜峰，提示 PCR無(wú)其它非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

再障患者端粒長(zhǎng)度較對(duì)照組明顯縮短(P<0.05)；NSAA組與對(duì)照組相比明顯縮短(P<0.05)；SAA組與對(duì)照組相比明顯縮短(P<0.05)；SAA組與NSAA組比較，端粒長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 再障患者端粒長(zhǎng)度變化情況

AA: aplastic anemia; NSAA: non-severe aplastic anemia; SAA: severe aplastic anemia.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsNSAA.

2 再生障礙性貧血患者P53和P21的mRNA表達(dá)水平

再障患者P53和P21的mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，分別是對(duì)照組的 22.12倍和3.70倍；NSAA組P53和P21的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯升高(P<0.05)；SAA組P53和P21的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯升高(P<0.01)；SAA組P53和P21的mRNA表達(dá)水平較NSAA組明顯增高，(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 再障患者P53和P21 mRNA 表達(dá)水平

AA: aplastic anemia; NSAA: non-severe aplastic anemia; SAA: severe aplastic anemia.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsNSAA.

3 再生障礙性貧血患者P53和P21的蛋白表達(dá)水平

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，再障患者P53和P21蛋白的表達(dá)情況均與其基因表達(dá)水平走向基本一致，較對(duì)照組明顯升高 (P<0.01)；NSAA組P53和P21蛋白的表達(dá)情況與對(duì)照組相比均明顯升高 (P<0.05)；SAA組P53和P21蛋白的表達(dá)情況與對(duì)照組相比均明顯升高 (P<0.05)；SAA組P53和P21蛋白的表達(dá)水平較NSAA組明顯增高 (P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The protein expression of P53 (A) and P21 (B) in the patients with aplastic anemia. Mean±SD. *P<0.05 vs control; △P<0.05 vs NSAA.

4 再生障礙性貧血患者端粒長(zhǎng)度、P53和P21表達(dá)水平之間的相關(guān)性比較

再障患者端粒長(zhǎng)度與P53、P21表達(dá)水平之間無(wú)相關(guān)性 (P>0.05)。P53與P21表達(dá)水平之間呈正相關(guān)(r=0.972，P<0.05)。

5 再生障礙性貧血患者骨髓造血細(xì)胞成分分布情況

再障患者骨髓造血細(xì)胞成分較對(duì)照組明顯減少(P<0.05);NSAA組骨髓造血細(xì)胞成分與對(duì)照組相比明顯減少 (P<0.05)；SAA組骨髓造血細(xì)胞成分與對(duì)照組相比明顯減少 (P<0.01)；SAA組骨髓造血細(xì)胞成分較NSAA組明顯減少 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

6 再生障礙性貧血患者骨髓CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比情況

再障患者骨髓CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯減少 (P<0.01);NSAA組骨髓CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比明顯減少 (P<0.05)；SAA組骨髓CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.01)；SAA組骨髓CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比較NSAA組明顯減少 (P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Hematopoietic components of bone marrow in the patients with aplastic anemia (HE staining, ×10). Mean±SD. *P<0.05 vs control; △P<0.05 vs NSAA.

Figure 3.CD34+ cell proportion in nuclear cells in severe aplastic anemia (SAA), non-severe aplastic anemia (NSAA) and control groups. Mean±SD. *P<0.05 vs control; △P<0.05 vs NSAA.

討 論

造血干/祖細(xì)胞缺乏導(dǎo)致的造血功能衰竭是AA的重要發(fā)病機(jī)制之一。造血干/祖細(xì)胞缺陷包括質(zhì)的缺陷和數(shù)量異常兩個(gè)方面，有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，AA患者骨髓中CD34+細(xì)胞的凋亡率增加是導(dǎo)致造血干細(xì)胞減少的主要原因。Callera等[6]檢測(cè)了11例AA患者(包括SAA 4例)骨髓活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其骨髓造血細(xì)胞的凋亡明顯增加，從而認(rèn)為AA骨髓中造血細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)的敏感性增加使細(xì)胞死亡加速，這是AA造血干/祖細(xì)胞減少的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，AA患者BMMNC中HSCs較正常人明顯減低，約為正常人的22%～68%，且SAA患者比NSAA患者CD34+細(xì)胞減少更明顯，提示CD34+細(xì)胞減少的程度可能與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，HSCs的減少可能是AA的主要發(fā)病機(jī)制之一。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AA患者骨髓CD34+細(xì)胞約占有核細(xì)胞的0.1%～0.3%，較對(duì)照組明顯減少，且SAA CD34+細(xì)胞減少更為顯著，與前人研究相符。已有研究證實(shí)[9]，F(xiàn)as/FasL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AA中發(fā)揮重要作用。正常個(gè)體CD34+細(xì)胞也會(huì)表達(dá)少量的Fas抗原，但是對(duì)Fas誘導(dǎo)的凋亡并不敏感，有研究[10]觀察了40例AA患者，其中CD34細(xì)胞明顯減少而其Fas表達(dá)率明顯增高，CD34+細(xì)胞數(shù)與其Fas抗原表達(dá)率無(wú)明顯負(fù)相關(guān)，這提示非Fas途徑誘導(dǎo)的凋亡過(guò)度可能導(dǎo)致了AA骨髓造血細(xì)胞數(shù)量的減少。

造血干/祖細(xì)胞質(zhì)的缺陷主要體現(xiàn)在集落形成能力降低、端?？s短、DNA 損傷修復(fù)能力降低、克隆演變等方面。大量研究證實(shí)所有AA患者造血功能均存在不同程度的缺陷，不僅表現(xiàn)為骨髓中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量降低，而且集落形成較正常人顯著減少[4，11]。本研究通過(guò)檢測(cè)AA患者骨髓病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，AA患者骨髓造血細(xì)胞成分較對(duì)照組明顯減少，再次證實(shí)AA患者存在造血功能的缺陷。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA 損傷后修復(fù)能力下降是細(xì)胞衰老的表現(xiàn)，這種細(xì)胞的增殖能力受損，而AA存在造血細(xì)胞的內(nèi)在增殖缺陷[12]。AA具有的有內(nèi)在增殖缺陷的干細(xì)胞可能是克隆性的，但是這種克隆性造血并不意味著克隆性增殖，也可能反映了干細(xì)胞池的耗竭，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓衰竭[13]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床觀察，發(fā)現(xiàn)部分AA可向骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)、急性白血病(acute leukemia, AL)和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)轉(zhuǎn)化，而MDS、AL和PNH都屬于惡性克隆性疾病，也進(jìn)一步說(shuō)明AA患者在發(fā)病或疾病進(jìn)展中存在著造血干/祖細(xì)胞的克隆性演變。

端粒位于染色體末端，其主要功能是預(yù)防染色體破壞，對(duì)保持染色體的完整性和穩(wěn)定性起重要作用。對(duì)正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)，當(dāng)進(jìn)行了一定次數(shù)的分裂后，端粒會(huì)逐漸縮短，當(dāng)縮短到一定程度就不能承擔(dān)保護(hù)染色體的責(zé)任，縮短到某一臨界長(zhǎng)度時(shí)，端粒功能就會(huì)產(chǎn)生異常，這些異常的端粒會(huì)被視為DNA損傷，從而引發(fā)損傷應(yīng)激反應(yīng)，如p53等抑癌基因的激活，從而使這些異常的細(xì)胞走向衰老、凋亡，甚或發(fā)生惡變。端粒的縮短和端粒功能的異常使染色體末端發(fā)生端端融合現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致染色體遺傳物質(zhì)的改變，如染色體非整倍體比例增多，染色體復(fù)雜易位以及染色體局部的擴(kuò)增和缺失等，這個(gè)過(guò)程會(huì)使大量細(xì)胞死亡，只有少數(shù)細(xì)胞由于激活端粒的維持機(jī)制而存活下來(lái)[14]。臨床上我們觀察發(fā)現(xiàn)，部分AA患者染色體亞二倍體占比增加，染色體不穩(wěn)定性增強(qiáng)，這可能與AA端?？s短、端粒功能異常有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)，AA患者的端粒長(zhǎng)度較對(duì)照組明顯縮短，且SAA較NSAA縮短更為明顯，提示端粒長(zhǎng)度的改變?cè)贏A的發(fā)病及疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮了重要作用，且與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。

p53基因位于17號(hào)染色體短臂，是一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。P53在正常情況下表達(dá)水平低且不穩(wěn)定。在受到如端粒縮短、DNA損傷等應(yīng)激時(shí)被激活，激活的P53能夠誘導(dǎo)下游多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。有研究證實(shí)，功能異常的端粒能夠激活 P53依賴的DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)[16]。此外，短的或接近功能異常的端粒對(duì)于依賴于P53信號(hào)的細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯比較敏感，P53活性的提高能夠更強(qiáng)地阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，P53活性增高會(huì)引起HSCs的功能下降，降低P53的水平可以改善老年動(dòng)物衰老的HSCs的功能[18]。應(yīng)用P53抑制劑能夠增強(qiáng)晚期人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的抗氧化應(yīng)激損傷能力，進(jìn)而恢復(fù)其增殖能力[19-20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AA患者P53 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，且SAA升高更為明顯，分析可能是活性明顯增高的P53引起了HSCs功能的下降，使其增殖能力明顯降低，其中SAA HSCs功能下降更為明顯。P53蛋白表達(dá)也說(shuō)明了這個(gè)結(jié)果。

p21基因定位于人染色體6p21.2，其DNA長(zhǎng)度為85 kb。P21蛋白是p21基因的表達(dá)產(chǎn)物，位于細(xì)胞核中，由164個(gè)氨基酸組成。p21基因是p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)抑制因子，能夠與cyclin D/CDK形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G1期，還能夠誘發(fā)G2/M阻滯，修復(fù)損傷的DNA[21]。研究表明[22]，P21可以通過(guò)2條途徑發(fā)揮作用，一條途徑是非P53依賴途徑，P21可以經(jīng)除P53外的其它因子誘導(dǎo)表達(dá)，從而發(fā)揮功能；另一條途徑是由P53介導(dǎo)的途徑，p21基因上游含有一個(gè)與P53結(jié)合的特異性位點(diǎn)，P53被異常激活后可迅速誘導(dǎo)p21基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而阻滯細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本次研究發(fā)現(xiàn)，AA患者P21 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，并且SAA升高更為明顯，而端粒長(zhǎng)度與P53或P21 mRNA表達(dá)水平之間沒(méi)有相關(guān)性。分析可能是AA端粒的縮短使端粒功能出現(xiàn)了異常，可能還存在端粒酶或者其它端粒相關(guān)蛋白的異常，多種因素共同作用，進(jìn)而誘發(fā)DNA損傷，引起損傷應(yīng)激反應(yīng)，激活P53，誘導(dǎo)p21基因轉(zhuǎn)錄，從而引起HSCs功能下降，細(xì)胞凋亡增加，干細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，SAA干細(xì)胞減少更為明顯，使骨髓造血衰竭，甚至可能引發(fā)克隆演變。P53與P21 mRNA表達(dá)水平之間呈正相關(guān)，推測(cè)p21基因可能通過(guò)依賴P53途徑誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

通過(guò)本研究，我們初步發(fā)現(xiàn)端粒、P53和P21可能參與了AA的發(fā)病經(jīng)過(guò)，端粒的縮短引起了DNA損傷，進(jìn)而激活P53和P21，影響了HSCs的增殖和分化，引發(fā)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為研究AA的發(fā)病機(jī)制和尋找靶向治療提供了新思路。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Telomere length and expression of P53 and P21 in BMMNC of patients with aplastic anemia

WANG Yan, XU Rui-rong, WANG Zhou, YANG Zhen, CUI Si-yuan, ZHANG Jie

(DepartmentofHematology,TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China.E-mail:xrr18@sina.com)

AIM: To investigate the pathogenesis of aplastic anemia (AA) through the expression of P53 and P21, and the telomere length in the bone marrow mononuclear cells (BMMNC) of patients with AA. METHODS: The BMMNC were collected from 60 cases of AA, including 38 non-severe aplastic anemia (NSAA) and 22 severe aplastic anemia (SAA), and 25 healthy controls. The mRNA expression of P53 and P21, and the telomere length were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), while the protein expression of P53 and P21 was determined by Western blot. The correlations among P53, P21 and telomere length were analyzed. Hematopoietic components of bone marrow were measured by bone marrow biopsy. CD34+cells proportion in nuclear cells were assessed by flow cytometry. RESULTS: Telomere length in the patients with AA, including NSAA and SAA, was significantly lower than that in control group (P<0.05). The same results of the hematopoietic components of bone marrow and the CD34+cells proportion in nuclear cells were observed. Telomere length in SAA group was shorter than that in NSAA group (P<0.05), while the hematopoietic components of bone marrow and the CD34+cells proportion in nuclear cells also showed the same results. The expression of P53 and P21 at both mRNA and protein levels in the AA patients, including NSAA and SAA, was signi-ficantly higher than that in control group (P<0.05). The expression of P53 and P21 in the SAA patients was higher signi-ficantly than that in the NSAA patients (P<0.05). No correlation between the expression of P53 or P21 and telomere length was found. There was significant positive correlation between the expression of P53 and P21 (P<0.05). CONCLUSION: Telomere length, P53 and P21 may be involved in the pathogenesis of AA by inhibiting the proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells, and triggering cell apoptosis.

Telomere length; P53; P21; Aplastic anemia

1000- 4718(2017)03- 0510- 07

2016- 10- 26

2016- 12- 21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No. 81303080)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2013ZDZK-037)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2014GSF119002)

△通訊作者 Tel: 0531-68616042; E-mail: xrr18@sina.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.021