李靜麗 張海祥 馮楊萌 王光華 劉永年 胡 軍

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研組，西寧810000)

禽流感病毒H5N1單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定①

李靜麗 張海祥②馮楊萌②王光華②劉永年 胡 軍②

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研組，西寧810000)

目的：探討禽流感病毒單克隆抗體的生物學(xué)特性。方法：制備H5N1禽流感病毒的單克隆抗體，鑒定其亞型、效價(jià)、血凝抑制活性以及與其他亞型流感病毒的交叉反應(yīng)性。免疫印跡方法驗(yàn)證單抗與H5N1抗原的結(jié)合，人體正常組織芯片的免疫組織化學(xué)染色法觀察單抗的組織學(xué)反應(yīng)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)兩株禽流感病毒H5N1的單抗(H5-32和H5-35)分別與人體的腎、胰腺組織存在陽(yáng)性結(jié)合。結(jié)論：禽流感病毒H5N1與人體組織間可能存在某種關(guān)聯(lián)，這或許可為禽流感病毒感染和致病研究提供參考。

禽流感病毒；單克隆抗體；特性；鑒定

禽流感病毒為正黏病毒科、流感病毒屬A型流感病毒，具有較強(qiáng)傳染性，主要在禽類中傳播，容易引發(fā)大面積的雞瘟疫病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)等造成極大危害。然而，上世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)禽流感病毒開始能直接感染人類，并造成流行，感染者表現(xiàn)為結(jié)膜炎、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭、腦膜炎，甚至死亡[1]。截至目前，感染人類的禽流感病毒已超過十多種[2]，其中，自2003年2月至2016年1月，高致病性禽流感病毒H5N1已造成了全球846人感染，449人死亡[3]；而僅僅2015年國(guó)內(nèi)感染H7N9禽流感病毒就高達(dá)196人，死亡92人，死亡率高達(dá)47%[4]。近年來(lái)，雖然學(xué)者們提出了細(xì)胞因子風(fēng)暴、補(bǔ)體過度激活等假說(shuō)[5-7]，但對(duì)于禽流感病毒在人類中傳播的致病機(jī)制目前尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)室制備H5N1禽流感病毒的單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，以期為禽流感病毒及其傳播致病研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 H5N1、H9N2、H7N2及H3N2病毒疫苗株購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司；甲型H1N1流感病毒裂解疫苗購(gòu)自華蘭生物疫苗有限公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠(8周齡,雌性)購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自中杉金橋公司；聚乙二醇購(gòu)自Sigma公司；mAb亞型鑒定試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP為Southern Biotech公司產(chǎn)品；HAT購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)用牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。人體正常組織芯片(包含33種器官，66個(gè)組織點(diǎn))購(gòu)自陜西超英生物科技有限公司，免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物免疫及單抗的制備 將H5N1禽流感疫苗經(jīng)異丁醇提取、超速離心和蔗糖梯度離心后，收集并與弗式完全佐劑乳化均勻，皮下免疫BALB/c小鼠，20～25 μg/只。3周后，加強(qiáng)免疫2次。融合前3 d，腹腔注射不含佐劑的抗原追加免疫。細(xì)胞融合方法參見文獻(xiàn)[8]。采用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，經(jīng)3次克隆化后，建立穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。將液體石蠟腹腔注射BALB/c小鼠，1周后，腹腔接種雜交瘤細(xì)胞株制備腹水并純化[9]。

1.2.2 單抗生物學(xué)特性分析

(1) 單抗的一般特性鑒定：包括抗體亞類的測(cè)定，采用SAB Clonotyping System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒，具體方法見說(shuō)明書；單抗的血凝抑制活性通過血凝及血凝抑制(HI)試驗(yàn)測(cè)定。(2)單抗特異性鑒定：采用間接ELISA方法，將雜交瘤細(xì)胞誘生的小鼠腹水純化后分別與人流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H7N2、H9N2做交叉反應(yīng)鑒定，同時(shí)以Sp2/0細(xì)胞上清液為陰性對(duì)照。(3)Western blot：將H5N1禽流感病毒裂解疫苗用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以純化的腹水作為一抗4℃孵育過夜，經(jīng)PBST洗后，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再用PBST清洗，最后經(jīng)DAB顯色。(4)免疫組化 將人體正常組織芯片脫蠟水化，3% H2O2處理消除組織中的內(nèi)源性過氧化物酶。用pH 6.0檸檬酸緩沖液微波加熱修復(fù)10 min，自然冷卻。加10%的山羊血清封閉處理1 h，棄上清，不洗，直接加一抗，4℃過夜。次日取出，室溫復(fù)溫1 h，經(jīng)PBS洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。經(jīng)PBS洗后，DAB顯色，蘇木素襯染，脫水封片，鏡下觀察并記錄。

染色結(jié)果參照Yu等[10]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，即根據(jù)每種組織細(xì)胞的著色強(qiáng)度及所占該類細(xì)胞的百分比劃分為0～3+四個(gè)層級(jí)。每個(gè)抗體與該種組織的4次免疫組化評(píng)分結(jié)果求平均值和誤差。分值0代表陰性；1+代表弱陽(yáng)性：2+代表中度陽(yáng)性；3+代表強(qiáng)陽(yáng)性，因此，我們將均值在1+以上的視為抗體與該組織存在結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 mAb的一般特性 通過免疫小鼠H5N1禽流感病毒疫苗，獲得分泌型雜交瘤細(xì)胞株，檢測(cè)各雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞上清中抗體效價(jià)和亞型，同時(shí)制備腹水并純化后測(cè)定抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)共得到39株單克隆抗體，以H5-1至H5-39表示，ELISA方法檢測(cè)與其他甲型流感病毒H1N1等的交叉反應(yīng)性；免疫組化方法檢測(cè)單抗與人體組織反應(yīng)性，其中發(fā)生明顯陽(yáng)性結(jié)合的抗體為H5-32、H5-35，其生物學(xué)特性見表1。

2.2 Western blot結(jié)果 抗體H5-32、H5-35與H5N1抗原進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示這兩株抗體與H5N1抗原均有特異性反應(yīng)條帶，分子量大小分別在60、50 kD左右，見圖1。

2.3 單抗與人體正常組織的結(jié)合情況 將本次所得的39株抗H5N1禽流感病毒的單抗分別與人體正常組織芯片做免疫組化染色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示單抗H5-32和H5-35與人體組織間存在明顯結(jié)合現(xiàn)象，其中抗體H5-32與腎臟組織有陽(yáng)性結(jié)合；抗體H5-35與胰腺組織有結(jié)合，見圖2、3。

圖1 Western blot結(jié)果Fig.1 Western blot assayNote: M.Protein marker;1.mAb H5-32;2.mAb H5-35.

表1 單克隆抗體一般生物學(xué)特性

Tab.1 Biological characteristic of AIV mAbs

mAbsSubtypeHeavychainLightchainTiterSupernatantAscitesHICross-activityH5-32IgMλ103105-H1N1H5-35IgG1λ104106+-

圖2 mAb與人體組織芯片的IHC結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 Statistical analysis on IHC of mAbs reaction of human tissue chip

圖3 mAb與人體正常組織的IHC結(jié)果Fig.3 IHC of mAbs reaction of human tissue chipNote: A.IHC of mAb H5-32 reaction of human kidney,renal tubules were dyed light brown；B.IHC of mAb H5-35 reaction of human kidney,pancreas cells were dyed brown.

3 討論

禽流感病毒自1878年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，主要在鳥類、水禽、家禽以及犬、馬、豬等物種傳播，引發(fā)的各種疫病給人民群眾造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前禽流感病毒已經(jīng)識(shí)別出18種HA和11種NA亞型[11]，據(jù)報(bào)道其中禽流感病毒H5N1、H7N9、H9N2等亞型已經(jīng)傳播到人類[12]，導(dǎo)致人類角膜炎、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭，甚至死亡，其危害十分嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)室制備禽流感病毒H5N1的單克隆抗體，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單抗H5-32為IgM亞類，無(wú)血凝抑制活性，與H5N1病毒在60 kD左右有特異性反應(yīng)條帶，同時(shí)又與H1N1病毒之間存在交叉反應(yīng)，由于多糖類抗原易引發(fā)IgM類抗體，說(shuō)明該單抗可能是抗病毒核蛋白上的多糖成分，雖然其免疫保護(hù)作用不強(qiáng)，但可以作為H1N1和H5N1的通用型抗體使用；單抗H5-35為IgG1亞類，具有血凝抑制活性，與H5N1病毒在56 kD左右有特異性反應(yīng)條帶，同時(shí)該單抗與其他流感病毒間不存在交叉反應(yīng)，說(shuō)明該抗體抗病毒血凝素，且其免疫原性和免疫保護(hù)作用均較好，可以用于H5N1禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的制備，及其流行的監(jiān)測(cè)和疫苗研究等。

此外，兩株單抗分別與人體腎組織和胰腺組織存在陽(yáng)性結(jié)合，這與以往禽流感病毒死亡病例的尸檢報(bào)道基本一致，感染禽流感患者除發(fā)生肺臟損傷外，也出現(xiàn)了心肌水腫、腎充血水腫、急性腎小管壞死等器官組織損傷現(xiàn)象[13,14]，提示我們H5N1禽流感病毒和人體組織間可能存在某種關(guān)聯(lián)。

目前，學(xué)者普遍認(rèn)為，禽流感病毒在人類機(jī)體中的致病過程大致與以下現(xiàn)象有關(guān)：細(xì)胞因子風(fēng)暴，即病毒感染會(huì)導(dǎo)致IL-1、IP-10、IL-6、TNF、IFN-γ、MCP-1等細(xì)胞因子顯著增高[5,6,15]；補(bǔ)體的過度激活，即C3、C5b-9和甘露結(jié)合凝集素(MBL)-C在肺組上的沉積以及MBL介導(dǎo)的絲氨酸蛋白酶-2和C3aR、C5aR的補(bǔ)體受體上調(diào)[7,16,17]。另外，Ahmed等證實(shí)流感病毒H1N1核蛋白上存在與人下丘腦泌素受體2細(xì)胞外區(qū)肽段結(jié)構(gòu)相似的表位，使患者機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗下丘腦泌素受體 2 的抗體并干擾下丘腦泌素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終誘生發(fā)作性嗜睡病[18]；Guo等[19]也發(fā)現(xiàn)H1N1的HA可能與人體組織腦、胰腺存在相似性抗原表位。這些均說(shuō)明禽流感病毒致病的罪魁禍?zhǔn)子锌赡懿⒎遣《颈旧恚乔萘鞲胁《窘俪只颊邫C(jī)體的自身免疫系統(tǒng)，其過度應(yīng)答造成細(xì)胞因子風(fēng)暴或補(bǔ)體的異常，使機(jī)體組織器官受到損傷進(jìn)而致病、致死[20]。

總之，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)禽流感病毒H5N1的單抗與人體組織存在陽(yáng)性結(jié)合，說(shuō)明兩者之間可能具有相似性抗原表位，從而劫持患者自身免疫系統(tǒng)導(dǎo)致機(jī)體損傷，這或許是禽流感病毒致病的可能原因之一。該抗體的獲得為H5N1禽流感病毒的檢測(cè)和流行監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)材料，也為禽流感病毒致病機(jī)理和相關(guān)疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2016-10-08 修回2016-11-07]

(編輯 張曉舟)

Identification on biological characteristics of AIV H5N1 monoclonal antibody

LIJing-Li,ZHANGHai-Xiang,FENGYang-Meng,WANGGuang-Hua,LIUYong-Nian,HUJun.

DepartmentofPathophysiology,MedicalCollege,QinghaiUniversity,Xining810000,China

Objective:To investigate the biological characteristics of monoclonal antibodies against avian influenza virus (AIV).Methods: Monoclonal antibodies (mAbs) against AIV H5N1 were prepared and it′s characteristics were identified including subtype,titer,hemagglutination inhibition activity and cross-reactivity with other influenza viruses.Besides,Western blot and immunohistochemical staining methods were conducted to test the combination of antibodies and antigen (H5N1) and human normal tissues.Results: Immunohistochemical analysis showed that 2 mAbs (H5-32 and H5-35) cross-reacted with human tissues kidney and pancreas respectively.Conclusion: These data indicated that there have some association between the AIV H5N1 with human tissues,which may provide reference for the study on avian influenza virus infection and pathogenicity.

Avian influenza virus;Monoclonal antibody;Characteristic;Identification

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.017

①本文受“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)(No.2014ZX10004002)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)”重點(diǎn)專項(xiàng)(No.2016 YFD0500700)資助。

李靜麗(1990年- )，女，在讀碩士，主要從事免疫學(xué)與藥理學(xué)方面的研究。

及指導(dǎo)教師：劉永年(1959年-),男,教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事高原病發(fā)病機(jī)制與預(yù)防方面的研究，E-mail: liuyongnian@qhu.edu.cn。 胡 軍(1962年-),男,博士，研究員,碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物與免疫學(xué)研究，E-mail: hjj6562@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2017)03-0398-04

②陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安710068。