梁 慧，宮 琦，程 濤，梁建輝，

（北京大學1.基礎醫(yī)學院藥理學系，2.藥學院分子與細胞藥理學系，北京 100191）

·論 著·

丁螺環(huán)酮和米安色林對梁氏情境應激箱誘導小鼠焦慮和抑郁樣行為的影響

梁 慧1，宮 琦1，程 濤2，梁建輝1，2

（北京大學1.基礎醫(yī)學院藥理學系，2.藥學院分子與細胞藥理學系，北京 100191）

目的 設計和建立梁氏情境應激箱，通過觀察抗焦慮和抗抑郁藥對小鼠行為學指標的影響，評價梁氏情境應激箱對小鼠焦慮和（或）抑郁樣情緒反應的誘導作用。方法 梁氏情境應激箱由中央?yún)^(qū)和3個外周臂構成。ICR小鼠分別ip給予抗焦慮藥物丁螺環(huán)酮（0.5和1.0 mg·kg-1）和抗抑郁藥物米安色林（0.25和0.5 mg·kg-1），觀察小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期、中央?yún)^(qū)停留時間、中央?yún)^(qū)活動路程、外周區(qū)活動路程、區(qū)域間穿梭次數(shù)和總活動度。結果 ①丁螺環(huán)酮0.5和1.0 mg·kg-1明顯縮短小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期，分別縮短了71.9%（P＜0.05）和77.9%（P＜0.05）；劑量依賴性地增加中央?yún)^(qū)停留時間，各增加了59.5%和73.8%（P＜0.05）；丁螺環(huán)酮0.5和1.0 mg·kg-1均可顯著減少小鼠區(qū)域間穿梭次數(shù)（P＜0.05），但對其中央?yún)^(qū)活動路程、外周區(qū)活動路程和總活動度無明顯影響；②米安色林0.25和0.5 mg·kg-1明顯縮短小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期，分別縮短了72.4%（P＜0.05）和82.3%（P＜0.05）；劑量依賴性地增加中央?yún)^(qū)停留時間，各增加了39.1%和43.9%（P＜0.05）；米安色林劑量依賴性地增加中央?yún)^(qū)活動路程（P＜0.05）及區(qū)域間穿梭次數(shù)（P＜0.05），但對外周區(qū)活動路程和總活動度無明顯影響。結論 梁氏情境應激箱對小鼠焦慮和（或）抑郁樣情緒反應具有明確的誘導作用，可作為一個新的焦慮抑郁共病動物模型研究其病理生理機制，篩選和評價新型抗焦慮和（或）抗抑郁藥物。

情境應激；焦慮；抑郁；共病現(xiàn)象；動物模型

焦慮和抑郁是2種目前全世界范圍內流行最為廣泛、發(fā)病率最高的情緒障礙，其中任何一種障礙都足以擾亂患者的社交、工作以及家庭生活，甚至出現(xiàn)嚴重的自傷自殺觀念或行為。傳統(tǒng)觀點一直將焦慮障礙和抑郁障礙視為2個獨立的疾病單元，在DSM-V，ICD-10和CCMD-3三個精神障礙分類體系中，二者均有各自明確的診斷標準［1］。然而，流行病學調查顯示，焦慮和抑郁共病的情況實則更為常見。在中國焦慮和抑郁的共病率保持在49%～69%［2-3］。在荷蘭，約67%的人明確表示近1年內曾被確診為焦慮和抑郁共病障礙［4］。與單純的焦慮或抑郁障礙相比，共病患者具有癥狀頑固［5］、臨床表現(xiàn)復雜、病情反復多變、診斷標準不統(tǒng)一、治療手段缺乏針對性、病程遷延［6］、預后不良［7-8］和復發(fā)率高等問題。由此可見，突破傳統(tǒng)觀點、關注共病障礙并積極開展相關研究工作是非常必要的。然而，就目前的研究現(xiàn)狀看，尚無被本研究領域公認的焦慮抑郁共病動物模型。此類動物模型的發(fā)展速度和共病研究的實驗需求之間存在著極大的矛盾，因此，需要建立一種新的焦慮抑郁共病動物模型。

雖然許多經典的焦慮和抑郁動物模型在相關研究中得到廣泛的應用，但是，這些動物模型都存在各自的缺陷。例如，高架十字迷宮及其衍生版本（高架T迷宮和高架O迷宮等）被廣泛用于焦慮障礙的相關研究。此類行為學實驗的結果雖簡單直觀，便于測量和統(tǒng)計分析，但易受眾多因素影響。在高架十字迷宮實驗中，動物大多能夠迅速適應實驗環(huán)境，放棄對開放臂的探索，長時間躲藏于閉合臂中。有時動物會直接從開放臂中逃逸，導致實驗失?。?］。強迫游泳實驗和懸尾實驗屬于經典的抑郁動物模型，但應激刺激方式過于劇烈，實驗過程中容易對動物的自身活動能力造成傷害，從而降低其模擬臨床抑郁癥的表面效度和結構效度［10］。曠場實驗主要用于觀測動物的一般活動度和探索行為，而并非是研究焦慮障礙的特異性實驗［11］。長期以來，各個實驗室對曠場實驗中央?yún)^(qū)范圍的界定都各不相同，導致對同一問題得出不同的，甚至截然相反的結論。此外，還有慢性不可預知性溫和應激模型，該模型表面效度和預測效度較高，但實驗過程繁復，需長期干預且結果重復性較差［12］。因此，建立和發(fā)明針對焦慮和（或）抑郁障礙新的實驗方法和動物模型具有十分重要的理論意義和實際應用價值。

情境應激（contextual-stress）是一種公認的焦慮和抑郁障礙的誘發(fā)因素，某些特定的場所和環(huán)境如迷宮、空曠廣場等可以誘發(fā)情境應激，產生焦慮、緊張、恐懼、沮喪、厭惡、抑郁、退縮等情緒和行為反應。本研究利用動物探索欲望與警覺回避的心理沖突，設計了一個由3個外周臂和圓形中央?yún)^(qū)組成的迷宮型實驗箱，即梁氏情境應激箱，觀察抗焦慮藥物丁螺環(huán)酮和抗抑郁藥物米安色林對梁氏情境應激箱誘導小鼠焦慮樣和抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性ICR小白鼠，體質量20～25 g（華阜康生物科技有限公司），生產許可證SCXK（京）2014-0004，合格證號（11401300032344，11401300032343）。動物房恒溫（23～21）℃、恒濕（30～50）%、自然光照，保持12 h晝夜節(jié)律（8：00-20：00）。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4～6只，食水不限。實驗開始前，小鼠須在動物房適應4 d以上，定時抓摸以消除應激反應。實驗流程遵循美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）實驗動物維護和使用指南（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，NIH Publications No.80-23，revised 1996）。

1.2 藥物

鹽酸丁螺環(huán)酮（英國Bristol-Myers公司），生理鹽水（河北天成藥業(yè)股份有限公司），米安色林（美國Sigma公司）。所有藥物均以0.9%生理鹽水為溶媒，實驗當天新鮮配置，腹腔注射體積為10 mL·kg-1。

1.3 儀器

梁氏情境應激箱（圖1）由1個圓形（直徑30 cm）的中央?yún)^(qū)和3個形狀相同的矩形（長×寬=25 cm× 15 cm）外周臂組成，外周臂等角度（0°，120°，240°）連接于中央?yún)^(qū)周圍。箱體材料為白色聚乙烯板材，四周有高25 cm的外墻圍繞。

1.4 動物分組和實驗步驟

實驗室保持恒溫（21～23）℃，恒濕（30～50）%，光照強度為10 lux。所有實驗均在14：00到19：00之間進行，避免晝夜節(jié)律對小鼠情緒的影響。提前1 h將小鼠移入實驗室，以適應環(huán)境改變。小鼠背部中央用黑色墨水標記，便于攝像頭捕捉其活動軌跡。每只小鼠只使用1次，每次實驗結束后需用75%乙醇擦拭梁氏情境應激箱，以消除前1只小鼠遺留的氣味干擾。

小鼠分別ip給予丁螺環(huán)酮（0.5和1.0 mg·kg-1）、米安色林（0.25和0.5 mg·kg-1）或生理鹽水（正常對照），30 min后單獨放入梁氏情境應激箱任意外周臂末端，面向中央?yún)^(qū)，任其自由探索15 min。用西班牙Panlab公司的SMART 3.0系統(tǒng)監(jiān)測小鼠的活動，并記錄：①首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期：實驗開始時，小鼠面向中央?yún)^(qū)，放入梁氏情境應激箱任意外周臂末端。該指標記錄小鼠首次從外周區(qū)（3個外周臂面積總和即為外周區(qū)）進入中央?yún)^(qū)的時間；② 中央?yún)^(qū)停留時間（time spent in central area，CA-time）；③中央?yún)^(qū)活動路程（distance traveled in central area，CA-distance）；④外周區(qū)活動路程（distance traveled in peripheral area，PA-dis?tance）；⑤區(qū)域間穿梭次數(shù)；⑥總活動度：用于描述小鼠在三維空間中的總活動程度，包括爬行、直立、點頭、嗅和理毛等行為。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 丁螺環(huán)酮對梁氏情境應激箱誘導小鼠焦慮樣行為的影響

表1結果表明，與正常對照組相比，丁螺環(huán)酮可明顯縮短小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期（F（2，21）= 5.17，P＜0.05），0.5 mg·kg-1組減少了71.9%，1.0 mg·kg-1組減少了77.9%。丁螺環(huán)酮0.5和1.0 mg·kg-1組小鼠中央?yún)^(qū)停留時間顯著延長（F（2，21）=3.91，P＜0.05），分別高于正常對照組59.5%和73.8%，而3組小鼠間中央?yún)^(qū)和外周區(qū)活動路程均無明顯差異。雖然丁螺環(huán)酮0.5和1.0 mg·kg-1可明顯減少小鼠在梁氏情境應激箱中的區(qū)域間穿梭次數(shù)（F（2，21）=5.43，P＜0.05），但是，對小鼠總活動度的影響無統(tǒng)計學意義。

2.2 米安色林對梁氏情境應激箱誘導小鼠抑郁樣行為的影響

表2結果顯示，米安色林0.25和0.5 mg·kg-1可使小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期明顯縮短（F（2，21）= 6.12，P＜0.01），與正常對照組相比分別縮短了72.4%和82.3%；小鼠的中央?yún)^(qū)停留時間（P＜0.05）由正常對照組的（195±72）s分別延長為（271±57）s和（281±48）s，分別增加了39.1%和43.9%。米安色林在不影響小鼠外周區(qū)活動路程的前提下，可顯著提高其中央?yún)^(qū)活動路程（F（2，21）=3.91，P＜0.05），0.25和0.5 mg·kg-1組小鼠分別高出生理鹽水組33.3%和43.6%。此外，米安色林還可明顯增加小鼠在梁氏情境應激箱中的區(qū)域間穿梭次數(shù)，0.25和0.5 mg·kg-1分別增加了10.4%和40.1%。統(tǒng)計分析和比較各組小鼠的總活動度，均未見顯著差異。

3 討論

本研究對梁氏情境應激箱誘導小鼠應激反應和行為表現(xiàn)進行了較為系統(tǒng)的、全面的解析，探討不同行為觀察指標的病理生理學意義及其可能的相關藥物研發(fā)的應用價值。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抗焦慮藥丁螺環(huán)酮和抗抑郁藥米安色林均可緩解梁氏情境應激箱對小鼠應激反應的誘導作用，對相關的行為觀察指標產生明確的藥理作用。由此可見，梁氏情境應激箱所誘導的應激反應和行為表現(xiàn)不但存在焦慮情緒反應，同時也包含抑郁情緒表現(xiàn)，值得深入探索。

Tab.1 Effect of buspirone on latency to central area（CA）,CA-time,CA-distance,PA-distance,shuttle number and global activity in ICR mice exposed to Liang′s box

Tab.2 Effect of mianserin on latency to CA，CA-time，CA-distance，PA-distance，shuttle number and global activity in ICR mice exposed to Liang′s box

動物疾病模型的表面效度（face validity）主要是指動物模型各項觀察指標的病理生理學意義，以及與臨床疾病可能的內在聯(lián)系［10］。梁氏情境應激箱設定了6個行為學觀察指標，從3個維度對小鼠的特定性行為進行了觀察和解析。第一，首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期和中央?yún)^(qū)停留時間，主要與小鼠的警覺回避有關，反映焦慮和（或）抑郁狀態(tài)。眾所周知，小鼠會本能地回避空曠的，沒有遮擋物保護的場所［13-14］。身處陌生環(huán)境時，動物一方面在好奇心的驅使下四處游走探索，另一方面則會出于自我保護意識，保持警惕，回避空曠的情境（場所）［15］。在梁氏情境應激箱中，相對外周區(qū)而言，中央?yún)^(qū)顯得更加空曠和復雜，容易引起小鼠警覺、回避、焦慮和（或）抑郁情緒反應。同樣利用動物的趨近-規(guī)避沖突而建立的模型還有許多，例如高架十字迷宮及其衍生版本（高架T迷宮，高架O迷宮）和曠場試驗。前者選擇動物首次進入開放臂的潛伏期和開放臂停留時間［16］，后者選擇動物中央?yún)^(qū)停留時間［17］來衡量動物的焦慮程度和評價抗焦慮藥物的藥理作用，它們均與本實驗結果相互支持。由此可見，上述行為實驗觀察指標具有相同的行為醫(yī)學和精神藥理學意義；此外，梁氏情境應激箱對小鼠形成了一種持續(xù)存在且無法控制的情境應激刺激，抑制了它的探究習性，小鼠呈現(xiàn)出一系列消極被動的行為反應，習得性無助抑郁模型也正是以此為理論基礎而建立的。第二，中央?yún)^(qū)活動路程和區(qū)域間穿梭次數(shù)反映小鼠探索新奇環(huán)境的欲望和動機，可能與抑郁情緒有關。與經典的曠場實驗箱相比較，迷宮型的梁氏情境應激箱就顯得更加復雜。因此，封閉的、復雜的、迷宮型的梁氏情境應激箱可能造成小鼠難以“逃避”的情境而產生“行為絕望”，即抑郁情緒。與強迫游泳等行為絕望類抑郁模型相同，在梁氏情境應激箱中小鼠可能會出現(xiàn)明顯的行為遲滯、快感缺失癥狀，其興趣、欲望和好奇心顯著降低，動機性和堅持性下降。第三，外周區(qū)活動路程和總活動度主要反映小鼠中樞神經系統(tǒng)的興奮狀態(tài)和運動功能。同樣，在曠場實驗中，通過測定動物的自主活動性，來評價藥物對中樞神經系統(tǒng)興奮水平和運動功能的影響［18-19］。

利用藥物明確的抗焦慮或抗抑郁藥理作用可以對動物模型的預測效度（predictive validity）作出評價［20］。研究資料表明，丁螺環(huán)酮對突觸前膜5-HT1A受體具有激動作用，反饋性地抑制神經末梢5-HT的釋放，降低中樞5-HT神經系統(tǒng)的功能水平，發(fā)揮抗焦慮作用［21］。米安色林屬于四環(huán)類抗抑郁藥［22］，主要通過調節(jié)中樞神經系統(tǒng)去甲腎上腺素的含量和釋放，產生抗抑郁作用［23-25］。采用上述2種藥物對梁氏情境應激箱的預測效度進行評價，結果表明，丁螺環(huán)酮和米安色林明顯縮短小鼠首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期，并呈劑量依賴性增加中央?yún)^(qū)停留時間?？菇箲]藥物和抗抑郁藥物明確的藥理作用幫助小鼠克服了對中央?yún)^(qū)的恐懼、焦慮情緒，提高了其對新奇環(huán)境的敏感度、探究興趣，說明首次進入中央?yún)^(qū)的潛伏期和中央?yún)^(qū)停留時間是評價梁氏情境應激箱誘導小鼠焦慮和（或）抑郁情緒反應重要的行為學指標和參數(shù)。與抗焦慮藥丁螺環(huán)酮減少區(qū)域間穿梭次數(shù)不同的是，抗抑郁藥米安色林明顯增加小鼠中央?yún)^(qū)活動路程和區(qū)域間穿梭次數(shù)，說明小鼠在藥物作用下，處于積極應對、掙扎或逃跑狀態(tài)，以求擺脫當前的受困局面。這2個行為學指標與抑郁情緒關系更加密切，可能與抗抑郁藥增加小鼠探索新奇環(huán)境的欲望和動機，增強其對持續(xù)應激刺激、挫敗和絕望的耐受性有關。必須強調的是，這2個行為學指標更加深入的行為醫(yī)學和精神藥理學意義有待進一步研究。無論是丁螺環(huán)酮還是米安色林對外周區(qū)活動路程和總活動度均無顯著性影響。外周區(qū)活動路程，尤其是總活動度主要反映中樞神經系統(tǒng)的興奮狀態(tài)。本研究結果說明所選用的藥物劑量既未產生非特異性的中樞抑制作用，又未產生明顯的中樞興奮效應。對行為觀察指標表面效度和藥物作用的預測效度進行綜合分析和比較，可以發(fā)現(xiàn)梁氏情境應激箱誘導小鼠焦慮和（或）抑郁的表面效度和預測效度具有很好的一致性和相關性，表明梁氏情境應激箱可以用來評價小鼠的焦慮和（或）抑郁情緒反應。

值得注意的是，本研究結果顯示，對于首次進入中央?yún)^(qū)潛伏期和中央?yún)^(qū)停留時間這兩個最為重要的觀察指標來講，不但抗焦慮藥丁螺環(huán)酮和抗抑郁藥米安色林均發(fā)揮了明確的藥理作用，且顯示出基本相同的藥理效應，提示梁氏情境應激箱對小鼠情緒應激反應的誘導作用，并非是單一的“心理沖突”誘導焦慮情緒，也可能是難以逃避的“行為絕望”。因此，從動物疾病模型的表面效度和預測效度來講，梁氏情境應激箱誘導小鼠的情緒障礙更有可能是一種焦慮和抑郁共患疾病動物模型。正如前所述，焦慮和抑郁共病障礙在臨床上更為常見。大量臨床資料表明，它們具有一系列共同的臨床表現(xiàn)［26］、行為特點、遺傳背景［27-30］、神經病理生理機制及生物學基礎［31］。本項研究工作初步的結果表明，梁氏情境應激箱對小鼠情境應激反應的誘導作用既能夠反映抑郁和焦慮情緒各自的變化，又能體現(xiàn)焦慮和抑郁共病的特點，為焦慮抑郁共病病理生理機制的研究和新型抗焦慮和（或）抗抑郁藥物篩選和評價提供新的研究手段和思路。

一個信度效度高、重復性好和經濟實惠的動物模型對于促進生物醫(yī)學研究有著十分重要的價值。部分學者積極研究并初步建立了幾個焦慮抑郁共病動物模型。比如Pandey等［32］利用金屬重物沖擊雄性Wistar大鼠頭部，造成創(chuàng)傷性顱腦損傷［33-34］，從而建立了創(chuàng)傷性顱腦損傷誘導的焦慮抑郁共病動物模型。然而，由于無法準確控制大鼠的損傷部位、范圍、嚴重程度及預后情況，該動物模型極不穩(wěn)定。H/Rouen小鼠是一種源于CD1小鼠的新動物品系。在小鼠懸尾實驗中，6周齡CD1小鼠靜止不動時間＞115 s者被認為是習得性無助小鼠［35-41］。然后，對習得性無助CD1小鼠進行育種和傳代，經過40代培育后，獲得穩(wěn)定的新動物品系，命名為H/Rouen小鼠。該品系小鼠可同時表現(xiàn)出焦慮和抑郁障礙的核心癥狀。但此種動物模型篩選過程繁瑣，育種時間漫長，耗時耗力，不適合大規(guī)模推廣。除此之外，還有以斑馬魚［40］和小雞［41］等非嚙齒類動物為主要實驗對象而建立的焦慮抑郁共病動物模型。與上述諸多動物模型比較，梁氏情境應激箱具有以下優(yōu)勢：①低成本、簡單易行，無需對實驗動物進行長期且復雜的訓練；②實驗時間短，獲得實驗結果快速直觀；③實驗程序規(guī)范，實驗條件可控性高，結果重復性好；④情境應激源誘導心理應激可以避免手術、電擊、禁食、懸尾和強迫游泳等軀體傷害性刺激；⑤與經典的曠場實驗箱相比較，梁氏情境應激箱中央?yún)^(qū)的界定明確和規(guī)范，可提高不同研究機構實驗數(shù)據(jù)的可比性。此外，迷宮型梁氏情境應激箱增加情境應激的復雜性和強度；⑥與高架十字迷宮等實驗相比較，封閉型梁氏情境應激箱可以防止動物逃逸；⑦梁氏情境應激箱設定6個行為學觀察指標，從3個維度對小鼠的特定性行為進行觀察和解析，可以全面多角度地評價小鼠在梁氏情境應激箱中的特定行為。

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Effect of buspirone and mianserine on anxiety-and depressionlike behaviors induced by Liang′s contextual-stress box in mice

LIANG Hui1,GONG Qi1,CHENG Tao2,LIANG Jian-hui1,2
(1.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Science,2.Department of Molecular and Cellular Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100191,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of anxiolytics and antidepressants on anxietyand/or depression-like behaviours induced by designing a Liang′s contextual-stress box,(Liang′s box) in mice.METHODS Liang′s box was composed of a central area and three peripheral arms.Buspirone (0.5 and 1.0 mg·kg-1)and mianserin(0.25 and 0.5 mg·kg-1)were injected to mice intraperitoneally and the following behavioral indexes were recorded:①latency to the central area(CA),②CA-time,③CA-distance,④distance traveled in the peripheral area(PA-distance)⑤number of the transitions,and⑥global activity.RESULTS①Buspirone 0.5 and 1.0 mg·kg-1decreased the latency to CA by as much as 71.9%(P＜0.05)and 77.9%(P＜0.05),but dose-dependently increased the CA-time by 59.5%and 73.8%(P＜0.05)respectively.Although buspirone 0.5 and 1.0 mg·kg-1obviously reduced the shuttle number(P＜0.05),it did not have significant pharmacological effects on the CA-and PA-distance or global activity.②Mianserin 0.25 and 0.5mg·kg-1decreased the latency to CA by as much as 72.4%(P＜0.05) and 82.3%(P＜0.05),but dose-dependently increased the CA-time by 39.1%and 43.9%(P＜0.05),respec?tively.Mianserin enhanced the shuttle number(P＜0.05)and CA-distance(P＜0.05)in a dose-dependent manner,but it had no obvious pharmacological effects on the PA-distance or global activity.CONCLUSION Anxiety-and/or depression-like behaviors can be stimulated by Liang′s box in mice,which may be used as a novel animal model of anxiety and depression comorbidity to study its pathophysiological mecha?nisms,screen and evaluate certain new anxiolytics and antidepressants.

contextual stress;anxiety;depression;comorbidity;animal model

LIANG Jian-hui,Tel:(010)82802452,E-mail:liangjh@bjmu.edu.cn

R964

A

1000-3002-（2017）02-0131-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.002

Foundation item:The project supported by National″the 12thFive-Year″Plan for Science and Technology Suport Pro?gram(2011BAK04B08)

2016-02-04接受日期：2016-08-26）

（本文編輯：喬 虹）

十二五科技支撐計劃項目（2011BAK04B08）

梁 慧，女，碩士研究生，主要從事神經精神藥理學研究，E-mail：sophia_lh@sina.cn；梁建輝，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事神經精神藥理學研究。

梁建輝，E-mail：liangjh@bjmu.edu.cn，Tel：（010）82802452