魏云計，朱臻怡，馮 民，何 健，沈金榮，何正和，秦 嫻，張伶俐，錢怡平，丁 濤

(1.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家飼料安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安)，江蘇 淮安 223001；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局 動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001 )

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留

魏云計1*，朱臻怡1，馮 民1，何 健1，沈金榮1，何正和1，秦 嫻1，張伶俐1，錢怡平1，丁 濤2

(1.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家飼料安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安)，江蘇 淮安 223001；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局 動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001 )

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定飼料中甲硝唑(MNZ)、甲硝唑代謝物(MNZOH)、二甲硝咪唑(DMZ)、二甲硝咪唑代謝物(HMMNI)、洛硝噠唑(RNZ)、異丙硝唑(IPZ)、異丙硝唑代謝物(IPZOH)殘留的分析方法。樣品經(jīng)0.1 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液和乙酸乙酯-丙酮(70∶30)提取，提取液經(jīng)分散型固相萃取填料N-丙基乙二胺(PSA)凈化后,再經(jīng)正己烷脫脂，液-液分配凈化，采用電噴霧電離源(ESI)正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，氘代同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法省去耗時的固相萃取過程，快速、簡單、高效，7種目標(biāo)分析物在2.0～100.0 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，在5.0～25.0 μg/kg范圍內(nèi)，3個加標(biāo)水平的回收率為72.4%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于12.5%；檢出限為2.5 μg/kg，定量下限為5.0 μg/kg。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；飼料；硝基咪唑類；代謝物

硝基咪唑類藥物是一種具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，常用的藥物主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑和洛硝噠唑等。此類藥物具有抗菌和抗原蟲作用，能殺滅和預(yù)防厭氧菌和病原蟲，可用于治療和預(yù)防家禽的滴蟲病和球蟲病、豬密螺旋體性痢疾及動物的各種厭氧菌感染。研究發(fā)現(xiàn)硝基咪唑類藥物具有潛在的致癌、致畸和致突變性[1-2]，因此歐盟、美國等國際組織和我國禁止在動物源性食品中使用此類藥物[3-4]。為保障動物源性食品安全，從源頭控制可食用動物對硝基咪唑類藥物的攝入，有效解決動物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留問題，因此研究飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物檢測的方法具有重要意義。

目前，關(guān)于動物源性食品、蜂產(chǎn)品及化妝品中硝基咪唑類藥物的殘留檢測方法報道較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、氣相色譜法(GC)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12-16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[17-23]等。HPLC和GC的靈敏度低，抗干擾能力差，對多組分物質(zhì)同時測定無法準(zhǔn)確定性定量分析；GC-MS的靈敏度雖然高，但需要衍生化，產(chǎn)生干擾物質(zhì)多，操作繁瑣；LC-MS/MS的靈敏度高，選擇性和抗干擾能力強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留分析，并適用于對成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾較大樣品的更準(zhǔn)確的定性、定量分析。

飼料中硝基咪唑類藥物殘留的分析方法目前已有報道，其前處理過程均使用固相萃取技術(shù)去除基質(zhì)干擾，使得實(shí)驗(yàn)過程繁瑣、周期長、成本高，并對環(huán)境污染大；關(guān)于飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留同時測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法尚未見報道。在已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，本文優(yōu)化了前處理提取方法，采用基質(zhì)分散固相萃取填料N-丙基乙二胺(PSA)凈化，正己烷脫脂，液-液分配凈化技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的強(qiáng)選擇性和抗干擾能力，建立了飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的快速定性定量方法。該方法的靈敏度高，無需固相萃取凈化，實(shí)驗(yàn)周期短，提高了工作效率，方法定量下限可滿足國家殘留監(jiān)控的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)；C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm ,Agilent公司)。甲醇(德國Merck公司)、甲酸(美國Tedia公司)、乙酸銨(美國ACS恩科公司)均為色譜純，乙酸乙酯、正己烷、丙酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀(南京化學(xué)試劑股份有限公司)均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。甲硝唑(MNZ)、甲硝唑代謝物(MNZOH)、二甲硝咪唑(DMZ)、二甲硝咪唑代謝物(HMMNI)、洛硝噠唑(RNZ)、異丙硝唑(IPZ)、異丙硝唑代謝物(IPZOH)、氘代二甲硝咪唑(DMZ-D3)、氘代二甲硝咪唑代謝物(HMMNI-D3)、氘代異丙硝唑代謝物(IPZOH-D3)標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度≥98%，用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

1.2 樣品前處理

稱取(1.00±0.05) g 飼料于50 mL 具塞離心管中，加入4 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸氫二鉀緩沖液，渦旋混勻30 s后待飼料浸潤，加入10 mL乙酸乙酯-丙酮(70∶30)混合溶劑，于渦旋混合器上快速混勻30 s，超聲波提取10 min；以8 000 r/min的速率離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)溶液至50 mL具塞離心管中，加入PSA粉末0.15 g，混勻30 s，靜置后轉(zhuǎn)移有機(jī)溶液至50 mL雞心瓶中，于40 ℃水浴中減壓濃縮至干，準(zhǔn)確加入1.00 mL甲醇-水(30∶70)混合溶液，渦旋后再加入0.5 mL正己烷渦旋，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，12 000 r/min離心1.5 min，取下層溶液過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶中，供儀器分析。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm )；流動相：A為 5 mmol/L乙酸銨水溶液，B 為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～3.0 min ，90% A；3.0～4.5 min，90%～35% A；4.5～5.0 min，35%～10% A；5.0～7.0 min，10% A；7.0～7.5 min，10%～90% A；7.5～9.5 min，90%A；流速：250 μL/min；進(jìn)樣量：25 μL；柱溫：30 ℃。

表1 硝基咪唑類藥物多反應(yīng)監(jiān)測模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters in multiple reaction monitoring(MRM) mode for nitroimidazoles

*quantitative ion

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，噴霧電壓：3 000 V，離子源溫度：400 ℃，鞘氣：45 bar，輔助氣：10 bar；離子傳輸管溫度:350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測，優(yōu)化質(zhì)譜條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物及其代謝物的極性較強(qiáng)，常用的提取溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等有機(jī)溶劑。由于二氯甲烷和三氯甲烷的毒性較強(qiáng)，一般不采用；甲醇、乙腈的極性較強(qiáng)，提取效率較高，但提取的基質(zhì)干擾物較多，基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯；乙酸乙酯極性較弱，對極性較強(qiáng)的甲硝唑代謝物提取效率低。考慮到硝基咪唑類藥物的極性及對溫度有一定的敏感性，實(shí)驗(yàn)選用沸點(diǎn)低、極性相對較強(qiáng)的乙酸乙酯-丙酮混合溶劑作為提取溶劑，以降低提取液在濃縮過程中溫度和時間對回收率的影響。實(shí)驗(yàn)對混合溶劑中乙酸乙酯和丙酮的不同體積比(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5)進(jìn)行優(yōu)化，在陰性豬飼料中添加50.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其絕對回收率(n=3)，結(jié)果表明，采用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)作為提取溶劑時，幾種硝基咪唑類藥物可以獲得最佳回收率。

硝基咪唑類作為一種堿性化合物，在堿性條件下呈游離分子態(tài)，為了使目標(biāo)分析物有效地從飼料基質(zhì)中提取出來，以提高絕對回收率，實(shí)驗(yàn)加入了磷酸氫二鉀緩沖液，使溶液呈堿性。飼料基質(zhì)中直接加入乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶劑提取的絕對回收率為36.1%～42.3%；而加入磷酸氫二鉀緩沖液后，再用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶劑進(jìn)行液-液分配萃取，可去除部分親水性雜質(zhì)，提取的絕對回收率為43.1%～58.9%。故實(shí)驗(yàn)采用磷酸氫二鉀緩沖液潤濕樣品，使溶液呈弱堿性，再用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)混合溶劑提取。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶劑對硝基咪唑類藥物的提取效率較高，但提取的脂性干擾物較多，需要進(jìn)一步凈化。本實(shí)驗(yàn)比較了固相萃取小柱HLB、MCX和分散型固相萃取填料PSA的凈化效果，發(fā)現(xiàn)HLB小柱、MCX小柱和PSA填料均有較好的富集凈化作用。采用HLB和MCX小柱凈化時，先采用有機(jī)溶劑提取目標(biāo)物、濃縮后，分別采用0.1 mol/L磷酸溶液溶解目標(biāo)物再凈化，過程復(fù)雜，經(jīng)過兩次濃縮，目標(biāo)物損失較多。由于PSA填料的主要成分是N-丙基乙二胺，能與飼料中的一些酸性化合物結(jié)合以去除基質(zhì)中的酸性干擾物，提高了回收率。同時飼料中脂肪含量較高，樣品經(jīng)過有機(jī)溶劑提取后，提取出較多脂肪，PSA填料不能有效將其去除，而在樣品定容后采用0.5 mL正己烷溶液進(jìn)行液-液分配萃取凈化去除脂肪，可達(dá)到較好的凈化效果。故本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取填料PSA和正己烷液-液分配萃取凈化技術(shù)，替代固相萃取小柱凈化，操作簡單，減少了有機(jī)溶劑的消耗，縮短了樣品前處理的時間，提高了工作效率。

2.3 濃縮條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物的熱穩(wěn)定性不好，本文對提取溶劑濃縮方式進(jìn)行優(yōu)化，考察了濃縮溫度40 ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、平行蒸發(fā)儀、氮吹儀3種不同濃縮方式對回收率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過上述3種濃縮方式處理后的絕對回收率依次為43.1%～58.9%，39.2%～56.4%，38.6%～55.7%，回收率略有降低；由于采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮處理的時間最短，目標(biāo)物受溫度影響最小，濃縮效率和回收率最高，故本文采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對提取液進(jìn)行濃縮。

圖1 飼料中添加硝基咪唑類藥物(5.0 μg/kg)及內(nèi)標(biāo)(20.0 μg/L)的MRM色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM) chromatograms of nitroi-midazoles(5.0 μg/kg) and internal standard(20.0 μg/L) spiked in feed sample

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限與定量下限

飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在基質(zhì)中存在明顯的基質(zhì)干擾現(xiàn)象。取空白基質(zhì)溶液和定容溶液分別配制成濃度為50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行測定，以基質(zhì)溶液配制目標(biāo)物的峰面積/無基質(zhì)溶液配制目標(biāo)物的峰面積×100%來評價基質(zhì)效應(yīng)。其中，基質(zhì)效應(yīng)數(shù)值越大，表明受基質(zhì)影響越??；數(shù)值越小，表明受基質(zhì)影響越大。數(shù)據(jù)顯示各目標(biāo)物均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)(見表2)，同時由于各目標(biāo)物無法采用一一對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量消除基質(zhì)效應(yīng)，因此本文采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/L)，分析物峰面積與選定內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。7種硝基咪唑類藥物在2.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。在空白飼料基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比(S/N)≥3時的含量定為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)≥10時的含量定為方法的定量下限(LOQ)，7種藥物的LOD為2.5 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg；飼料中添加硝基咪唑類藥物的MRM色譜圖見圖1。

表2 硝基咪唑類藥物在飼料中的基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Matrix effects,linear equations,correlation coefficients(r2),limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of nitroimidazoles in feed

2.5 回收率與精密度

在陰性飼料樣品中添加硝基咪唑類混合標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平分別為5.0，10.0，25.0 μg/kg，每個添加水平5次平行，內(nèi)標(biāo)法定量，得到方法回收率及精密度，結(jié)果見表3。硝基咪唑類藥物的平均回收率為72.4%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.8%～12.5%。

表3 飼料樣品中硝基咪唑類藥物的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of nitroimidazoles in feed sample(n=5)

2.6 實(shí)際樣品的檢測

采用本方法對本地區(qū)出口的水產(chǎn)飼料和畜禽飼料共43個樣品進(jìn)行測定，所有樣品中均未檢出硝基咪唑類藥物，說明所檢測的飼料樣品中未添加硝基咪唑類藥物。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的分析方法。采用分散型固相萃取凈化技術(shù)，并優(yōu)化了樣品前處理的凈化方法。該方法簡便快速，省去固相萃取步驟，縮短了檢測周期，減少了有機(jī)溶劑消耗，且靈敏度較高，回收率好，可滿足實(shí)際檢測工作的需要。

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Rapid Determination of Nitroimidazoles and Their Metabolites Residues in Feeds by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WEI Yun-ji1*,ZHU Zhen-yi1,FENG Min1,HE Jian1,SHEN Jin-rong1,HE Zheng-he1,QIN Xian1,ZHANG Ling-li1,QIAN Yi-ping1,DING Tao2

(1.State Key Laboratory of Feed Safety Testing(Huaian),Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Huaian 223001,China;2.Animal,Plant and Food Inspection Center(APFIC) of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was developed for the rapid determination of metronidazole(MNZ)，metronidazole-OH(MNZOH),dimetridazole(DMZ)，hydroxydimetridazole(HMMNI),ronidazole(RNZ),ipronidazole(IPZ),ipronidazole-OH(IPZOH) residues in feed.The samples were extracted with 0.1 mol/L pH 8.0 phosphate buffer and ethyl acetate-acetone(70∶30，by volume)，then cleaned up with matrix solid-phase dispersant primary secondary amine(PSA).The extracts were defatted with hexane and cleaned up by liquid-liquid partition.The target compounds were detected by electrospray ionization(ESI) in positive mode using multiple reaction monitoring,and quantified by the isotope internal standard method.No solid-phase extract(SPE) procedure was adopted，which made sample preparation simple and efficient.The calibration curves for seven target compounds were linear in the range of 2.0-100.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.99.Average recoveries at spiked levels of 5.0-25.0 μg/kg were between 72.4% and 95.6%，with relative standard deviation less than 12.5%.The limits of detection(LOD) were 2.5 μg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) were 5.0 μg/kg.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；feed;nitroimidazoles;metabolites

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.014

2016-09-09；

2016-10-23

質(zhì)檢總局科技計劃項(xiàng)目(2015IK131)

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0377-05

*通訊作者：魏云計，碩士研究生，工程師，研究方向：食品及飼料安全檢測，Tel：0517-83336508，E-mail:jswyj_84@163.com