林 欽，鄭小嚴，陳 純，戴 明，周燕瓊，張 英

(1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

研究報告

UPLC-Q-TOF/MS在烘焙食品中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸檢測中的應用

林 欽1*，鄭小嚴1，陳 純2，戴 明1，周燕瓊2，張 英2

(1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

建立了烘焙食品中羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)的UPLC-Q-TOF/MS檢測方法。烘焙食品經脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解釋放出CML和CEL，使用FMOC-Cl柱前衍生和HLB小柱固相萃取凈化后，采用UPLC-Q-TOF/MS檢測。CML和CEL在1～700 ng/mL濃度范圍內均呈良好的線性關系，線性回歸系數(shù)r>0.999。CML和CEL的檢出限均為0.1 mg/kg；回收率為94.4%～108.3%；相對標準偏差(RSD，n=6)為0.4%～6.2%。該方法定性、定量準確，靈敏度高，能很好地應用于烘焙食品中CML和CEL的檢測。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀；烘焙食品；羧甲基賴氨酸；羧乙基賴氨酸

羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)是食品在加工過程中發(fā)生美拉德反應時產生的蛋白質化學修飾以及生物體內的糖氧化、脂質氧化和羰基應激的一個重要的生物指標。它是晚期糖基化終末產物(Advanced glycosylation end products，AGEs)最主要的單體之一，常作為食品中或生物體內AGEs含量的重要生物標記物。AGEs與許多疾病的病理機制有關，與人類健康有著密切聯(lián)系，它積累于機體的不同組織器官，如血管內皮細胞、神經細胞、腎皮質等組織纖維，不僅可以直接影響細胞和組織功能，參與疾病的產生，也可通過與特異受體結合發(fā)生反應來改變蛋白質和細胞功能，導致機體的病理變化，如糖尿病及其多種并發(fā)癥[1]。

建立靈敏、有效的AGEs檢測以及鑒定方法，并研究抑制AGEs的形成是國內外的一個研究重點。福建省是烘焙食品的生產和消費大省，市場正以每年20%以上的增速穩(wěn)步遞增，全省規(guī)模企業(yè)的產值已超過50億元，并向規(guī)?；?、品牌化的方向發(fā)展。由于烘焙食品常具有高糖、高脂特點，又由高溫烘焙制得，因此，最容易產生美拉德反應，如何控制好美拉德反應和提高加工工藝是企業(yè)長遠發(fā)展亟需面對的問題。

目前，已報道的CML檢測方法有：(1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[2-3]。通過單克隆抗CML抗體來檢測CML，但該方法的缺點是缺乏選擇性和非特異性，可能會出現(xiàn)假陽性或導致實驗結果過高。(2)液相色譜法。使用高效液相色譜結合熒光檢測器對樣品中的CML進行分析時，需采用衍生劑鄰苯二甲醛對樣品進行柱前衍生[4-5]，但該方法衍生產物不穩(wěn)定；或采用FMOC-Cl對生物樣品進行柱前衍生[6]，CML在激發(fā)波長260 nm和發(fā)射波長310 nm處有特征吸收峰，利用熒光檢測器對其進行定性及定量，但該方法耗時長，干擾較大，定量準確度差。(3)使用氣相色譜-質譜法(GC-MS)[7-9]。該方法需采用易揮發(fā)的衍生劑對樣品進行衍生，衍生時間較長，并且操作過程比較復雜。(4)液相色譜-串聯(lián)質譜檢測法[10]。該方法的缺點是離子抑制較強，樣品前處理和流動相中均使用九氟戊酸離子對試劑，該試劑易在質譜儀中殘留，造成儀器靈敏度下降，并且由于處理后溶液中離子對試劑含量的不同會造成CML和CEL色譜峰的保留時間不穩(wěn)定，不利于定性與定量分析。本研究在已有文獻方法的基礎上進行優(yōu)化和改進，采用柱前衍生化、固相萃取、UPLC-Q-TOF/MS、同位素稀釋等技術同時檢測烘焙食品中CML和CEL含量，具有高效、準確、靈敏的特點。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配G2-S QTof質譜儀(美國沃特世公司)；20管固相萃取裝置(美國安捷倫公司)；DHG-9140A恒溫干燥箱(上海精宏試驗設備有限公司)；Avanti J-E冷凍高速離心機(美國貝克曼公司)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司，Advantage)；BSA224S分析天平(賽多利斯北京有限公司)；渦旋混合器(美國熱電，VORTEX MAXI MIXⅡ)。

1.2 試劑和材料

實驗用水為超純水；甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)；衍生劑：9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl，色譜純，純度≥97.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；標準品：羧甲基賴氨酸(C8H16N2O4，純度98%)、氘代羧甲基賴氨酸(CML-D4，C8H12D4N2O4，純度98%)均為加拿大TRC公司生產；羧乙基賴氨酸(C9H18N2O4，純度98.6%)和氘代羧乙基賴氨酸(CEL-D4，C9H14D4N2O4，純度91.1%)為法國PolyPeptide Laboratories生產；固相萃取柱：Oasis HLB 60 mg/3 mL(美國Waters公司)，使用前分別以2 mL甲醇和2 mL 0.5%甲酸溶液活化平衡，保持柱體濕潤。各種代表性樣品，包括油炸食品(薯片、薯條、沙琪瑪?shù)?、焙烤食品(曲奇、面包、餅干等)均購自當?shù)爻小?/p>

標準溶液和內標溶液配制：分別準確稱取適量CML和CEL標準品，用70%甲醇(如無特殊說明均為體積分數(shù))溶解配成CML和CEL濃度約為200 μg/mL的標準儲備溶液，置于4 ℃冰箱中保存；分別稱取適量的CML-D4和CEL-D4標準品，用70%甲醇溶液溶解配制成約40 μg/mL的內標標準儲備溶液，置于4 ℃冰箱中保存；移取適量CML和CEL標準溶液，準確加入同位素內標溶液，用水稀釋定容至5 mL，混勻；標準系列濃度約為1～700 ng/mL，內標濃度均為80 ng/mL。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品處理方法 稱取1.0 g(精確至0.1 mg)研磨粉碎后的樣品置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL正己烷，充分渦旋，于4 ℃，10 000 r/min離心3 min，棄去正己烷層，重復上述正己烷脫脂過程2次，氮吹(40 ℃)揮去正己烷。向脫脂后的樣品中加入10 mL 0.2 mol/L硼砂鹽緩沖液，渦旋混勻，加入1.0 mL 2 mol/L硼氫化鈉溶液，輕輕振搖混勻，4 ℃放置過夜。還原后的樣品中加入2.5 mL 60%(質量分數(shù))三氯乙酸溶液，混勻，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，吸出上清液棄去。將離心管中沉淀的物質用20 mL 6 mol/L HCl溶液轉移至50 mL水解反應釜中，110 ℃下水解22～24 h，取出冷卻至室溫。將水解液用水轉移定容至50 mL容量瓶中，混勻，濾紙過濾，收集濾液。準確吸取1.00 mL濾液于5 mL刻度試管中，加入2 mL水，再加入100 μL濃度均為4.0 μg/mL 的CML-D4和CEL-D4同位素內標混合溶液，混勻，用50%(質量分數(shù))KOH溶液調pH值為7.0～9.0，用水定容至5 mL，渦旋混勻備用。

1.3.2 樣品的衍生和凈化 準確移取上述溶液500 μL，加入500 μL乙腈，渦旋混勻，加入200 μL 5%(質量分數(shù))硼砂溶液和200 μL 15 g/L FMOC-Cl乙腈溶液，渦旋混勻，靜置10 min，加入10 μL甲酸，混勻，再用40%乙腈溶液稀釋至約3 mL，渦旋混勻；將該衍生后溶液以1～2滴/s的速度過Oasis HLB 60 mg/3 mL固相萃取柱，待樣液完全流出后，用2 mL 40% 乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2 mL二氯甲烷淋洗，棄去全部流出液，真空抽干，最后用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脫，真空抽干并收集流出液。將洗脫液于40 ℃氮吹濃縮至近干，用50%乙腈溶液溶解殘留物定容至2 mL，渦旋混勻，過0.22 μm PTFE濾膜后上機測試。

1.4 UPLC-Q-TOF/MS分析條件

1.4.1 色譜分析條件 色譜柱：Waters BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A為0.5%甲酸溶液，B為乙腈；洗脫梯度：0～4.5 min，50%～41% A；4.5～5.0 min，41% A；5.0～7.0 min，41%～2% A；7.0～9.0 min，2%～50% A。

表1 主要質譜參數(shù)Table 1 Q-TOF/MS parameters

1.4.2 Q-TOF/MS分析條件 電離源：大氣壓電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細管電壓3.00 kV；源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流量700 L/h；錐孔反吹氣流量50 L/h；檢測方式：MS Scan靈敏度模式；掃描m/z范圍：500～900 Da；掃描時間：0.3 s；采集時間：3～6.5 min；質量校準溶液：1 ng/mL腦啡肽溶液；校準液m/z：556.277 1；校準頻率：10 s；定量離子質量精度：0.02 Da；特征離子及參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

取濃度約為800 ng/mL的CML，CEL，CML-D4和CEL-D4混合標準溶液，按“1.3.2”步驟衍生和凈化處理，由于處理后溶液中仍含有大量衍生副產物，直接注入質譜儀掃描時，目標物的峰往往掩蓋在大量的雜質峰下，不利于分辨。因此，本研究將標準處理溶液經色譜柱分離后，根據出峰時間進行質譜全掃描，得到比較簡單的質譜掃描圖。掃描結果發(fā)現(xiàn)在ESI(+)模式下，衍生物加H+后得到上述4種化合物的母離子m/z分別為649.255 6，663.269 7，653.280 5，667.294 8，同時還存在加Na+的離子峰，m/z為671.237 5，685.250 7，675.262 1和689.276 1，其優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)見表1，研究顯示加H+模式具有更好的靈敏度。

已有文獻建立了采用UPLC-MS/MS檢測CML和CEL的方法[11]，但發(fā)現(xiàn)大量的食品樣品均存在某種氨基酸類物質，該物質與CML難以達到基線分離，其衍生產物的質荷比(653.198 3)與CML-D4(653.277 0)非常接近，并且具有相同的碎片離子，因此，在只能達到單位質量分辨的情況下，該物質的存在會造成一定的定量偏差。本研究利用Q-TOF/MS高質量分辨的特點，在分辨率為0.1 Da時排除了該雜質對CML-D4的干擾，同時，即使將分辨率降到0.01 Da，對峰高也基本無影響，因此，為保證檢測的靈敏度并盡可能減少干擾，本方法最終設定質量分辨率為0.02 Da。由于CML-D4和干擾雜質碰撞碎裂后得到的靈敏度最大的碎片離子均為衍生劑碎片(m/z179.086 1)(見圖1)，采用Q-TOF/MS的MSMS模式將達不到分離干擾的目的，因此，本方法采用Q-TOF/MS的MS模式檢測，經優(yōu)化后最終確定的質譜儀參數(shù)如“1.4.2”。

圖1 CML和CEL的衍生途徑和碰撞碎裂產物圖Fig.1 Proposed reaction schematic for the derivatization of CML and CEL with FMOC-Cl and their proposed fragmentation pathways

圖2 標準品的總離子流圖和提取離子監(jiān)測圖Fig.2 TIC and quantitative ion chromatograms of standard

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本方法采用超高效液相色譜技術和美國Waters公司1.7 μm粒徑的C18色譜柱，具有極高的分離效率，考察了純水-乙腈體系、0.1%甲酸-乙腈體系、0.3%甲酸-乙腈體系、0.5%甲酸-乙腈體系作為流動相的分離效果，實驗發(fā)現(xiàn)0.5%甲酸-乙腈體系時，待測物CML與CEL具有最佳的峰形、分離度和靈敏度。調整洗脫梯度為“1.4.1”條件時，色譜分離圖見圖2。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

FMOC-Cl以其反應產物穩(wěn)定、反應速度快且完全而成為一種十分理想的對氨基酸分析的衍生試劑[11]。本研究使用在UPLC-MS/MS檢測法[12]中研制的FMOC-Cl柱前衍生和固相萃取方法處理樣品。由于CML和CEL在食品中主要以與蛋白質中的氨基殘基結合的方式存在，其蛋白加成產物一旦形成是非常穩(wěn)定且不可逆的[13]。因此，目前文獻基本采用將樣品按脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟來釋放樣品中的CML和CEL[14]。本實驗比較了4種樣品處理方法的CML和CEL檢測結果：①將樣品直接酸水解；②將樣品按脫脂、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟處理；③將樣品按脫脂、還原、沉淀蛋白、酸水解蛋白的步驟處理；④用水直接提取，在與水解法同樣稀釋倍數(shù)下測定樣品中游離的CML和CEL濃度；同時將按方法③處理樣品檢測結果，以及與UPLC-MS/MS法檢測結果相比較，結果見表2。

表2 不同處理方法和檢測方法的結果比較(n=3)Table 2 The result comparsion of different processing methods and detection methods(n=3) ρ/(μg·L-1)

表2結果表明，未經還原處理的樣品(方法①②)測得的CML含量明顯高于經過還原處理的樣品(方法③)，說明硼氫化鈉(NaBH4)能有效抑制CML的形成，NaBH4將形成CML的主要中間產物Fructoselysine(FL,果糖賴氨酸)還原為己糖醇賴氨酸，終止其在水解過程中氧化裂解生成CML[15]。因此，在測定生物樣本或食品體系中CML的含量時，通常需將樣品經過NaBH4還原處理，防止在高溫水解過程中賴氨酸與糖類反應可能轉化為CML，導致樣品中CML的含量測定值過高。結果(方法④)還表明樣品中的游離CML和CEL約占總量的0.6%～13%，CML和CEL在食品中主要以結合的方式存在。比較UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS檢測結果，CEL的檢測結果基本一致，CML的結果則由于CML-D4與干擾物的分離不完全，造成UPLC-MS/MS檢測結果偏低約3%～9%。由此可確定，采用方法③的處理步驟和UPLC-Q-TOF/MS的檢測方法能夠得到最佳的檢測結果。

2.4 線性范圍與檢出限

在1～700 ng/mL濃度范圍內，以進行衍生反應的標準工作溶液濃度(X)為橫坐標，以CML和CEL定量離子峰面積除以內標峰面積的值與內標濃度的乘積(Y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，線性方程CML為Y=0.625X-0.483，CEL為Y=1.606X-1.486，相關系數(shù)均達到0.999。由最低濃度標準溶液的峰高與噪音的信噪比按3倍噪音峰高計算得到CML和CEL的儀器檢出限均為0.1 mg/kg，按10倍噪音峰高計算CML和CEL的儀器定量下限均為0.3 mg/kg；同時，用CML濃度為11.0 ng/mL，CEL濃度為8.4 ng/mL的薯片樣品峰高按3倍噪音峰高和10倍噪音峰高計算CML的方法檢出限和定量下限分別為0.04 mg/kg和0.14 mg/kg，CEL的方法檢出限和定量下限分別為0.05 mg/kg和0.15 mg/kg。用標準工作曲線對試樣中待測組分進行內標法定量，試樣溶液的響應值應在標準工作曲線的線性范圍內。本方法具有良好的線性范圍和靈敏度，適合對烘焙食品中微量CML和CEL的檢測。

表3 不同烘焙食品中CML和CEL的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of CML and CEL in different baking food samples(n=6)

2.5 回收率與精密度

實驗發(fā)現(xiàn)烘焙食品中均含有CML和CEL，因此，取CML和CEL含量較低的薯片、沙琪瑪和蛋糕3種樣品進行3個水平的標準加標試驗，每個加標做6個平行，結果見表3。該方法對CML的回收率為94.4%～107.2%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～6.2%；對CEL的回收率為94.5%～108.3%，RSD為0.9%～6.2%?？梢娫摲椒▽ML和CEL均具有良好的回收率和精密度，適合烘焙食品的檢測。

2.6 實際樣品的檢測

采集市場上福建省企業(yè)生產的薯片、餅干和蛋糕等烘焙和油炸類等樣品68個批次，采用本方法進行檢測，由于CML和CEL的生成與蛋白質特別是蛋白質中賴氨酸的含量有很大的關系，因此，本文參照國外文獻[14]檢測了食品樣品中的蛋白質和賴氨酸含量，并將CML和CEL含量進行相應折算，檢測結果見表4。

表4 市售各類加工食品中CML和CEL的實測含量(n=3)Table 4 Contents of CML and CEL in various processed foods(n=3)

(續(xù)表4)

SamplenameCMLCELSample(mg/kg)Protein(mg/kg)Lysine(mmol/mol)Sample(mg/kg)Protein(mg/kg)Lysine(mmol/mol)Sesamepeanutpastry11.7070.132.1520.39122.223.51Coffeepastry114.18137.366.869.2289.314.18Coffeepastry220.43229.9516.2612.12136.349.02Sodabiscuit18.6847.911.388.4546.601.26Sodabiscuit28.3652.011.457.3045.411.18Digestivebiscuit18.92154.053.6124.06195.814.30High-fiberbranfriedbiscuit17.22135.193.0121.59169.543.53Coarsegraincookies11.8086.802.4216.96124.713.26High-fiberwholegrainsbiscuits13.95114.432.6221.68177.843.80Nutcracker24.74145.583.0710.9264.291.27Lowsugarseaweedcake6.9439.581.204.6926.720.76Porkflossbread7.7356.420.688.5762.540.71Greenbeancake114.51160.966.7014.12156.686.11Greenbeancake29.5991.022.774.3241.041.17OtherfoodsMeatfloss61.18127.951.1573.03152.741.28Popcorn3.3876.423.677.12160.917.23Littlefragile(puffedfood)1.47104.082.851.87131.893.38Cornbeans(puffedfood)3.9642.711.2110.63114.533.03Steamedcake5.1747.540.602.6724.600.29

從測定結果看，油炸類食品薯片、薯條和沙琪瑪?shù)戎械腃ML和CEL含量分別在2.55～6.63 mg/kg和1.92～6.93 mg/kg之間。焙烤類食品包括面包、蛋糕、曲奇、餅干等，CML的含量在6.79～66.14 mg/kg之間，CEL的含量在4.15～39.52 mg/kg之間。同一種食品，可能由于生產工藝控制的不同，造成了產品中CML和CEL含量有很大區(qū)別，如7個華夫餅中有5個的CML和CEL含量均在20～25 mg/kg和20～30 mg/kg之間，但有1個為40.82 mg/kg和37.52 mg/kg，另有1個為66.14 mg/kg和39.52 mg/kg；3個歐式蛋糕中，2個CML和CEL含量均在8 mg/kg和9 mg/kg左右，但有1個含量為23.16 mg/kg和17.20 mg/kg。此外，采用較低溫度制作的蒸蛋糕中CML和CEL的含量明顯低于高溫烘烤的蛋糕。同時，分析發(fā)現(xiàn)以蛋白質含量折算的烘焙食品中CML含量在39.58～477.53 mg/kg蛋白之間，以賴氨酸含量折算的烘焙食品中CML含量在0.32～16.26 mmol/mol賴氨酸之間；以蛋白質含量折算的烘焙食品中CEL含量在24.60～285.38 mg/kg蛋白之間，以賴氨酸含量折算的烘焙食品中CEL含量在0.37～15.37 mmol/mol賴氨酸之間。可見，食品中CML和CEL含量與蛋白質含量或賴氨酸含量不存在簡單的定量關系，其含量與食品中糖類、脂肪含量及加工工藝等都有很大關系，這些還有待今后做更細致的研究。

3 結 論

本文建立并優(yōu)化了UPLC-Q-TOF/MS同步檢測烘焙類等食品中CML和CEL的方法，與UPLC-MS/MS檢測方法相比，本方法有效解決了相近分子量氨基酸對檢測的干擾，具有更優(yōu)的定性、定量能力，在實際樣品檢測中取得了良好的效果，有助于指導生產工藝的改進。該方法適用性好，準確度和靈敏度高，能很好地應用于食品中CML和CEL的檢測。

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Application of Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry in Determination of CML and CEL in Baking Foods

LIN Qin1*，ZHENG Xiao-yan1，CHEN Chun2，DAI Ming1，ZHOU Yan-qiong2，ZHANG Ying2

(1.Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

A method was developed for the determination of Nε-(carboxymethyl)lysine(CML) and Nε-(carboxyethyl)lysine(CEL) in baking food using ultra performance liquid chromatography-quadrupole Time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS).CML and CEL were released from the baking foods through the process of sample degreasing，reduction reaction，precipitation and acid hydrolysis of acquired protein，treated by pre-column derivation with FMOC-Cl，and purified with HLB solid-phase extraction(SPE) column.Then the contents of CML and CEL in pretreated samples were determined by UPLC-Q-TOF/MS.All the target compounds exhibited good linearity(r>0.999) over the concentration range of 1-700 ng/mL.The detection limits of CML and CEL were all 0.1 mg/kg and the mean recoveries were in the range of 94.4%-108.3% with relative standard deviations(RSD,n=6) of 0.4%-6.2%.The method was accurate and sensitive，and was suitable for the detection of CML and CEL contents in baking foods.

ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)；baking foods；Nε-(carboxymethyl)lysine(CML)；Nε-(carboxyethyl)lysine(CEL)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.001

2016-08-15；

2016-10-26

福建省科技廳民生科技專項(2013Y6003)

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)03-0297-08

*通訊作者：林 欽，高級工程師，研究方向：食品安全檢測，Tel:0591-83762015，E-mail：phlqfcii@126.com