張偉，張海飛，馬杰，趙靜，柴智，劉建春，宋麗娟，姜維佳，肖保國,4，馬存根1,

法舒地爾對SH-SY5Y細胞氧糖剝奪后突觸損傷的影響

張偉1,2，張海飛2，馬杰1,2，趙靜1,2，柴智3，劉建春3，宋麗娟3，姜維佳3，肖保國3,4，馬存根1,3

目的：探討法舒地爾（Fasudil）對人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）氧糖剝奪（OGD）后突觸損傷的影響。方法：培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，分為空白對照組、OGD組、OGD+法舒地爾組，各3皿。相差光學顯微鏡下觀察細胞突觸損傷及修復的細胞形態(tài)；Western-Blot檢測ROCKⅡ、磷酸化肌球蛋白磷酸酶（p-MYPT1）、突觸后致密物-95（PSD-95）、突觸素（Synaptophysin）等蛋白的表達情況。結果：形態(tài)學顯示法舒地爾可有效修復OGD誘導的神經突觸損傷。OGD組ROCKⅡ及p-MYPT1的表達明顯高于空白對照組（P＜0.05），突觸素及PSD-95的表達明顯低于空白對照組（P＜0.01）。OGD+法舒地爾組ROCKⅡ及p-MYPT1表達水平低于OGD組（P＜0.05），而與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；突觸素和PSD-95表達水平高于OGD組（P＜0.01）；PSD-95表達水平高于空白對照組（P＜0.05），突觸素的表達與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結論：法舒地爾可有效修復OGD誘導的神經突觸損傷，增加PSD-95、突觸素的表達，抑制ROCKⅡ及p-MYPT1的表達。

法舒地爾；SH-SY5Y細胞；氧糖剝奪；ROCKⅡ；磷酸化肌球蛋白磷酸酶；突觸后致密物-95；突觸素

對于急性腦梗死，臨床上除了早期靜脈溶栓及橋接動脈取栓或溶栓治療外，尚無特別有效的治療方法，且能夠及時接受上述治療的患者極少[1-3]。尋求有效的治療方法一直是關注的熱點。

SH-SY5Y細胞來源于神經系統(tǒng)發(fā)育的神經嵴，是一種分化程度較低、繁殖快的腫瘤細胞。其細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經細胞極為相似?，F(xiàn)被廣泛應用于神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及藥物作用機制方面的研究[4-6]。氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD）是建立細胞缺血缺氧模型慣用的細胞建模技術[7]。近年來研究顯示缺血缺氧損傷可通過激活Rho/ROCK信號通路進而引起神經元突起回縮、細胞骨架塌陷、細胞凋亡。有效地抑制Rho/ ROCK信號通路的激活則可促進神經細胞突起延長、細胞骨架重構，發(fā)揮修復作用[8]。本課題擬用OGD的方法處理SH-SY5Y細胞建立缺血缺氧損傷模型，體外模擬急性腦卒中的病理生理改變，然后給予Rho激酶抑制劑法舒地爾（Fasudil）干預，研究其形態(tài)學及突觸素（synaptophysin）、突觸后致密物-95（postsynaptic densities，PSD-95）的改變，為Rho激酶抑制劑法舒地爾治療卒中，改善神經功能，預防卒中后認知功能障礙提供新的實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y神經元由復旦大學神經病學研究所肖保國教授友好提供，培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中（10%胎牛血清，1%雙抗）。胎牛血清和雙抗購于美國Gibco公司，抗磷酸化肌球蛋白磷酸酶（p-myosin phosphatase-1，p-MYPT1）抗體購于Cell Signaling Tech公司，BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；兔抗ROCKⅡ抗體（Anti-ROCK2 Rabbit pAb）購自BD Biosciences公司，兔抗突觸素抗體（Rabbit Anti-Synapsin 1）購自Epitomics公司，抗PSD-95抗體（PSD-95 polyclonal antibody）購自Cell Signaling Tech公司；鹽酸法舒地爾購于天津紅日藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SHSY-5Y細胞以1×105/mL接種于10 cm2的培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)液，并以100 mL/ L的濃度加入胎牛血清、以100 U/mL的濃度加入青霉素和鏈霉素（完全培養(yǎng)液），然后置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實驗分為：空白對照組，OGD組，OGD+法舒地爾組，各3皿。

1.2.2OGD處理當細胞生長狀態(tài)良好，細胞密度約60%時，進行OGD處理：空白對照組細胞在正常細胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，OGD組細胞換成無糖完全培養(yǎng)液，置Forma Anaerobic System（Thermo，USA）進行OGD[N2/CO2/O2(94%/5%/＜1%)]培養(yǎng)3 h，然后將液體換成含糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。OGD+法舒地爾組則加入法舒地爾干預，濃度為15 μg/mL。3組細胞在正常細胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察各組細胞在正常細胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在Olympus CK×41倒置相差顯微鏡下觀察其突觸損傷及修復情況。

1.2.4 蛋白表達測定各組細胞在正常細胞培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞離心（2 000 rpm，4℃，10 min），用PBS洗滌2次。然后，將沉淀細胞置于玻璃勻漿管中，在4℃條件下用組織裂解液提取蛋白，并測定和調整組織提取液中的蛋白濃度。制備SDS-PAGE 10%分離膠和5%濃縮膠。然后用微量加樣器在凝膠小槽內加30 μg蛋白上樣電泳分離。電泳完畢后采用BioRad標準濕式轉膜裝置進行轉膜。轉膜完畢后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h，然后加入相應抗體：anti-ROCK II，anti-p-MYPT1，anti-突觸素，anti-PSD-95和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，4℃孵育過夜。次日洗膜后，加相應HRP耦聯(lián)的抗兔和抗鼠的IgG室溫孵育1 h，用BIO-RAD儀器進行化學發(fā)光法顯色，將所得的譜帶經Image--LAB軟件分析相應的譜帶灰度值，用GAPDH作為內參，得出各標本的譜帶密度相對值，取各組平均值進行比較。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和單尾檢驗，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。

2 結果

2.1 法舒地爾干預OGD損傷的SH-SY5Y細胞的形態(tài)學觀察

正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞胞體多數(shù)呈梭形或三角形，少數(shù)呈多邊形，突觸生長良好、伸展性好、連續(xù)性好、胞質清亮、貼壁能力強。OGD損傷后細胞胞體變小、形狀不規(guī)則，突觸明顯受損，不連續(xù)，有斷裂現(xiàn)象，胞質透光度增加、貼壁差。法舒地爾+OGD組細胞胞體接近正常胞體，可見部分受損突觸得以修復，總體形態(tài)更接近于正常細胞形態(tài)，見圖1。

2.2 法舒地爾干預OGD損傷的SH-SY5Y細胞的ROCKⅡ及p-MYPT1表達

Western blot顯色譜帶顯示，OGD組ROCKⅡ及p-MYPT1的表達明顯高于空白對照組（P＜0.05），顯示OGD可以誘導ROCK的表達和活性。OGD+法舒地爾組ROCKⅡ及p-MYPT1表達水平低于OGD組（P＜0.05），而與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。提示法舒地爾抑制Rho/ROCK通路激活，減少其下游蛋白的表達。

2.3 法舒地爾干預OGD損傷的SH-SY5Y細胞突觸素及PSD-95表達

Western blot顯色譜帶顯示，OGD組突觸素及PSD-95的表達明顯低于空白對照組（P＜0.01）。OGD+法舒地爾組突觸素和PSD-95表達水平高于OGD組（P＜0.01）；PSD-95表達水平高于空白對照組（P＜0.05），突觸素的表達與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖1 法舒地爾干預OGD損傷SH-SY5Y細胞后形態(tài)學改變

圖3 法舒地爾干預OGD損傷的SH-SY5Y細胞突觸素及PSD-95表達

3 討論

神經細胞在缺血缺氧損傷情況下表現(xiàn)為細胞死亡和凋亡2種病理生理過程，研究顯示在腦缺血后神經細胞凋亡在腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，也是腦缺血損傷的重要發(fā)病機制之一[9]。細胞凋亡的重要病理環(huán)節(jié)包括細胞骨架坍陷、胞體縮小、突觸受損、核凝集、染色體降解等[10]。而突觸受損后修復包括內源性和外源性2種路徑，內源性途徑多與基因有關，外源性途徑多與內環(huán)境和某些蛋白和信號通路激活有關[11]。通過實驗筆者發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細胞在OGD損傷后表現(xiàn)為胞體變小、突觸變細甚至斷裂的現(xiàn)象，而經法舒地爾干預后突觸有明顯的再生和修復的跡象，細胞整體的形態(tài)接近于正常細胞。有理由相信Rho激酶抑制劑法舒地爾對缺血缺氧損傷的神經細胞具有修復的作用，特別是對受損的突觸具有保護或再生的能力。同時本實驗中也發(fā)現(xiàn)在OGD+法舒地爾組細胞的突觸素和PSD-9表達顯著高于OGD組，而ROCKⅡ、p-MYPT1的表達顯著低于OGD組。推測法舒地爾可能是通過抑制Rho/ ROCK信號通路激活，從而增加突觸相關蛋白突觸素和PSD-95的表達，形成對細胞突觸的保護和再生的作用。但Rho/ROCK信號通路與突觸素和PSD-95確切關系尚不明確，有待進一步深入研究。

近年來大量研究證實腦缺血后可通過激活Rho/ ROCK信號通路引起神經元突起回縮、細胞骨架降解進而加速神經細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮可以通過Rho激酶依賴的機制導致病理性突觸喪失[12]。抑制Rho/ROCK信號通路則可促進神經元突起延長、細胞骨架重構，從而發(fā)揮保護作用[8]。ROCKⅡ是該過程中起主導作用的亞型[13]，所以抑制ROCKⅡ的激活和表達也成為抑制Rho/ROCK信號通路的主要靶點。磷酸化肌球蛋白磷酸酶（p-MYPT1）是ROCK蛋白最具特殊意義的一個底物，常被用來評價ROCK的活性[14]。法舒地爾是目前在臨床上唯一使用的ROCK抑制劑，在細胞水平可以調節(jié)細胞增殖、遷移黏附、細胞骨架重構、胞質移動、免疫細胞運動等，同時在分子基因水平還可調節(jié)炎癥相關因子[15]。Feske等[16]研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可以促進神經軸突生長、抑制炎性細胞的活化、減少炎性介質的聚集和釋放、從而保護受損神經元。

突觸素是與突觸囊泡膜相聯(lián)系神經元特異性磷酸蛋白家族中的一員，定位于前突觸。突觸素在中樞神經元突起的形成、延伸、連接、維護以及神經元極性形成過程中扮演著重要角色[17]。研究顯示突觸素可與多種具有SH3結構的蛋白質相結合，提示突觸素可能與Rho蛋白的信號通路聯(lián)系起來對神經元突觸發(fā)揮作用。詳細機制尚不明確，有待更加深入的研究[18]。PSD-95隸屬于膜相關的鳥苷酸激酶（MAGUK）家族，主要參與突觸的可塑性調節(jié)[19]。Gasco’n等[20]通過栓塞大鼠大腦中動脈1 h后再灌注24 h的動物實驗中發(fā)現(xiàn)PSD-95在缺血側皮質的表達顯著低于非缺血側皮質。這一結果與本研究結果基本一致，均提示腦缺血早期PSD-95表達減少。Chen等[21]通過用插線法制備大鼠2 h腦缺血模型，然后再灌注3 d后，通過腦立體定位技術分別將神經干細胞（neural stem cells，NSCs）以及膠質細胞源性神經生長因子基因修飾的神經干細胞（glial cell line-derived neurotrophic factor/neural stem cells，GDNF/NSCs）移植到同側側腦室，同時用生理鹽水對照。分別在再灌注1、2、3、5和7 w后處死大鼠，通過免疫組織化學顯色的方法觀察腦缺血區(qū)域的突觸素和PSD-95的表達，結果顯示GDNF/NSCs組和NSCs組較對照組突觸素和PSD-95的表達顯著增加。他們認為NSCs移植后可能增強神經元功能以及促進神經環(huán)路的重建，從而促進梗死后神經功能障礙的恢復。

綜上所述，Rho激酶抑制劑法舒地爾除了可有效改善微循環(huán)、抑制炎癥反應、保護神經元之外，同時對受損神經元的突觸具有良好的保護和修復功能，有望改善腦梗死患者的遠期預后。

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（本文編輯：唐穎馨）

Synaptic Protective Effect of Fasudil on SH-SY5Y Cells Synapses after Oxygen-glucose Deprivation

ZHANGWei1,2,ZHANGHai-fei2,MAJie1,2,ZHAOJing1,2,CHAIZhi3,LIUJian-chun3,SONGLi-juan3,

JIANGWei-jia3,XIAOBao-guo3,4,MACun-gen1,31.DepartmentofNeurology,FirstClinicalMedicalCollege, ShanxiMedicalUniversity,Shanxi030001,China;2.DepartmentofNeurology，TheFifthpeople’shospitalof Datong,Shanxi037009,China;3.“2011”CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology, ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanxi030024,China;4.InstituteofNeurology,Huashan HospitalFudanUniversity,Shanghai200025,China

Objective:To investigate the effect of Fasudil on synaptic regeneration and repair of SH-SY5Y cells after oxygen-glucose deprivation(OGD).Methods:SH-SY5Y cells were cultured,and randomly divided into three groups:control group,OGD group and OGD+Fasudil group.The morphology of synaptic injure and repair was observed by phase contrast microscopy,and the expressions of ROCKII,phosphorylated myosin phosphatase 1(p-MYPT1),postsynaptic density(PSD)-95 and synaptophysin were evaluated by western blot assay. Results:Compared with those in the control group,the cytological morphology and synapses were significantly injured in the OGD group,which were obviously restored to the normal state in the OGD+Fasudil group.Cells in the OGD group had higher expressions of ROCKII and p-MYPT1(P＜0.05)and lower expressions of PSD-95 and synaptophysin(P＜0.01)than those in the control group.Cells in the OGD+Fasudil group had lower expressions ROCKII and p-MYPT1(P＜0.05)and higher expressions of PSD-95 and synaptophysin than those in the OGD group(P＜0.01).The expression of PSD-95 in the OGD+Fasudil group was higher than that in the control group(P＜0.05).The expressions of ROCKII,p-MYPT1 and synaptophysin showed no differences between the OGD+Fasudil group and control group(P＞0.05).Conclusion:Fasudil promots synaptic regeneration and repair of SH-SY5Y cells after OGD condition.Fasudil increases the expressions of PSD-95 and synaptophysin,as well as decreases expressions of ROCKII and p-MYPT1 in SH-SY5Y cells.

Fasudil;SH-SY5Y;oxygen-glucose deprivation;ROCKII;p-myosin phosphatase-1;postsynaptic densities-95;synaptophysin

R741；R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.02.002

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經內科太原 030001

2.大同市第五人民醫(yī)院神經內科山西 037009

3.山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經生物學研究中心太原 030024

4.復旦大學華山醫(yī)院神經病學研究所上海 200025

國家自然科學基金2012年面上項目（No.81272163）

山西省回國留學人員重點科研資助項目（No.2014-重點7）山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃項目（No.2011PY-1）

2016-12-02

馬存根macungen2001@ 163.com