韓福新，張蕊，馬善波，王彥剛

miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性

韓福新a，張蕊b，馬善波c，王彥剛a

目的：研究miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷提供相關(guān)依據(jù)。方法：選取2011年4月至2015年4月第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院收治的60例經(jīng)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤的患者作為實(shí)驗(yàn)組，分為低級(jí)別組（經(jīng)檢查腫瘤級(jí)別為I級(jí)和II級(jí)）和高級(jí)別組（經(jīng)檢查腫瘤級(jí)別為III級(jí)和IV級(jí)）。另選取15例經(jīng)體檢證實(shí)為健康人作為對照組。使用RT-qPCR檢測3組血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量，并且進(jìn)行比較。結(jié)果：3組血清miRNA-21（F=5.497，P=0.006）、miRNA-221（F=7.615，P=0.001）和miRNA-222（F=6.304，P=0.003）含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清miRNA-21、miRNA-221含量在對照組最低，在高級(jí)別組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血清miRNA-222含量高級(jí)別組高于對照組（P＜0.05），而低級(jí)別組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：腦膠質(zhì)瘤患者的血清miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222都呈高表達(dá)狀態(tài)，提示其與腦膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展有密切聯(lián)系；監(jiān)測血清miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222的含量可以對腦膠質(zhì)瘤患者的早期診斷、分級(jí)和預(yù)后評估等提供重要依據(jù)。

腦膠質(zhì)瘤；微小核糖核酸-21；微小核糖核酸-221；微小核糖核酸-222

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，由于常發(fā)生在患者的神經(jīng)外胚層，所以也常稱之為神經(jīng)上皮腫瘤或神經(jīng)外胚層腫瘤[1]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，70%的惡性腫瘤都為原發(fā)腫瘤[2]。近年來，高發(fā)生率和高死亡率使惡性腫瘤備受關(guān)注。在我國，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在33.3%～60.0%，其中男性患者多于女性患者，每年有將近3萬人死于該腫瘤[3]。雖然膠質(zhì)瘤可以發(fā)生在任何年齡階段，目前來看，患者多為成年人，30～40歲為腫瘤發(fā)病的高峰期[4]。發(fā)病的兒童占少數(shù)，一旦發(fā)病，多位于小腦。成人多見于幕上。膠質(zhì)瘤為浸潤型腫瘤，切除后常復(fù)發(fā)，患者的臨床癥狀與患者的發(fā)病部位，腫瘤的病理類型和分期等密切相關(guān)[5]。最常見的膠質(zhì)瘤癥狀為間斷性頭痛、顱內(nèi)壓增高、失明、精神改變、癲癇、視力減退、噴射性嘔吐、性格改變、復(fù)視等，嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)大小便失禁和偏癱等[6]。這些臨床癥狀的出現(xiàn)大多是由于患者相應(yīng)功能區(qū)受損，壓迫或者侵蝕[7]。若膠質(zhì)瘤患者能夠得到早診斷、早治療，患者的生命健康和生存質(zhì)量將得到大大提高。

目前膠質(zhì)瘤的確診依靠術(shù)后組織病理檢查，雖然影像學(xué)檢查也能發(fā)現(xiàn)異常，但是很難分期，無法準(zhǔn)確得知腫瘤的惡性程度。近年來，醫(yī)學(xué)工作者們都在積極尋找相關(guān)腫瘤標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系非常密切，對膠質(zhì)瘤的診斷顯得尤為重要而受到極大的關(guān)注[8]。miRNA可以調(diào)控很多轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，作用于下游的靶蛋白，調(diào)控腫瘤基因或者腫瘤抑制基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的分化，增殖，轉(zhuǎn)移和生長等。本研究探索了腦膠質(zhì)瘤患者血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量與腫瘤良惡性的關(guān)系，現(xiàn)將具體的研究過程和研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

將60例術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者納入實(shí)驗(yàn)組。病理切片顯示：I級(jí)膠質(zhì)瘤8例（13.3%），II級(jí)膠質(zhì)瘤10例（20.0%），III級(jí)膠質(zhì)瘤18例（30.0%），IV級(jí)膠質(zhì)瘤24例（36.7%）。低級(jí)別組包括I級(jí)和II級(jí)膠質(zhì)瘤患者，18例；高級(jí)別組包括III級(jí)和Ⅳ膠質(zhì)瘤患者，42例。對照組為經(jīng)體檢證實(shí)為健康人的非腫瘤者15例。

1.2 方法

1.2.1 提取血清總RNA采集3組患者的血液標(biāo)本放置于－80℃保存。將3組血液標(biāo)本離心后取血清部分，血清中RNA含量較低，為提高RNA獲取率，采用mirvanaTMPARTSTM Kit進(jìn)行提取。具體步驟：（1）在1.5 mL EP管中加入血清375 μL，再加入375 μL 2×Denaturing Solution后充分混勻，放置在冰上5 min；（2）加入650 μL酸酚氯仿，充分混勻；（3）在室溫下離心5 min分離有機(jī)相和水相（1 mL）；（4）將水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，記錄其體積；（5）將水相預(yù)熱洗脫到95℃；（6）加入100%乙醇（水相的1.25倍），充分混勻。（7）放置過濾柱到收集管中；（8）吸取一定量乙醇和裂解液的混合物放置于過濾柱上，每個(gè)過濾柱僅限700 μL液體；（9）離心15 s后將混合物過濾，離心10 000 rpm；（10）重復(fù)此過程直到混合液完全過濾，收集；（11）使用700 μL miRNA的洗脫液洗脫過濾柱，離心；（12）在過濾柱上加入500 μL混

有乙醇的洗液，逐漸減少洗液的量，重復(fù)上一步驟；（13）棄去收集管中的液體，將過濾柱放置于收集管上，離心；（14）去掉剩余液體；（15）將過濾柱轉(zhuǎn)移至新的收集管中，無核酸酶水或預(yù)熱的洗脫液100 μL放置于過濾柱中心，蓋上收集管管蓋，離心，最后回收RNA；（16）收集系統(tǒng)池，凍存在-20℃或者直接使用。

1.2.2 使用紫外吸收測定患者血清RNA濃度RNA和蛋白質(zhì)在波長260 nm和280 nm處測定相應(yīng)物質(zhì)的吸光度，推算出血清RNA的濃度和純度。純凈的RNA樣本其A260 nm/A280 nm比值大于2.0。有異硫酸胍污染時(shí)，A260 nm/A280 nm比值為0.5。當(dāng)A260 nm/A280 nm比值較低時(shí)，說明樣本中存在DNA或蛋白質(zhì)的污染，應(yīng)該再次提取。

1.2.3 RT-qPCR檢查 根據(jù)測得的濃度取其3 μg總RNA設(shè)為模版，添加2 μl Random Rrimer中，同時(shí)加以10 μlDEPC處理水進(jìn)行補(bǔ)足，經(jīng)65℃變性3 min后即刻放在冰盒中；添加2μl的RNA酶抑制劑，3 μl的5×RT buffer，2 μl的Rever Tra Ace以及3 μl的dNTP。經(jīng)25℃下反應(yīng)3 min，再于40℃下進(jìn)行反應(yīng)1h，75℃下3 min對其中AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行滅活，10℃8 min。最終將所獲取的cDNA產(chǎn)物放在-18℃條件下進(jìn)行留存。按照表1配置PCR相關(guān)反應(yīng)液。然后放入反應(yīng)儀器，設(shè)置相關(guān)參數(shù)：95℃10 min，95℃15 s，60℃60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。半定量分析處理：采集3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，并在含有1.0 μg/μl溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳操作。通過Quantity One軟件對其面積灰度進(jìn)行計(jì)算，將灰度值作為期表達(dá)水平，且經(jīng)相應(yīng)U6表達(dá)量對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

表1 PCR反應(yīng)液體系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組患者血清miRNA-21（F=5.497，P=0.006）、miRNA-221（F=7.615，P=0.001）和miRNA-222（F=6.304，P=0.003）含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清miRNA-21和miRNA-221含量在對照組最低，在高級(jí)別組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血清miRNA-222含量在高級(jí)別組高于對照組（P＜0.05），而低級(jí)別組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2，圖1，2。

表2 3組血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量比較（nmol/L，x±s）

圖1 部分標(biāo)本的RNA電泳圖

圖2 3組血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量比較

3 討論

現(xiàn)今，治療膠質(zhì)瘤應(yīng)用最廣泛的方法是手術(shù)治療輔以放化療，這種治療方法效果明確且可以降低患者的死亡率和致殘率，提高患者術(shù)后生活水平和生存時(shí)間[8]。膠質(zhì)瘤大多數(shù)的生長方式為浸潤生長，醫(yī)生在進(jìn)行手術(shù)時(shí)難以分清正常組織和膠質(zhì)瘤的界限，常常導(dǎo)致腫瘤無法完全切除，存在術(shù)后復(fù)發(fā)等一系列的難題[9]。所以膠質(zhì)瘤患者在術(shù)后一般都會(huì)運(yùn)用放療和化療等手段對患者進(jìn)行進(jìn)一步治療。另有很多患者由于腫瘤接近功能區(qū)、病變較小或者患者的年齡大、并發(fā)癥多、身體條件差等原因不進(jìn)行手術(shù)治療，而單純采取放療和化療[10]。

在正常人和腫瘤患者的血清中都存在miRNA，并且可以對其進(jìn)行定量檢測。由于患者所患疾病的類型不同，其外周血中可以檢測到的RNA的種類和表達(dá)的量都不一樣。血液中miRNA是穩(wěn)定存在的并且可以通過一定的方法定量檢測，關(guān)于這一觀點(diǎn)，可以通過以下3點(diǎn)對其進(jìn)行證明：①血液中存在大量DNA酶或者RNA酶，可能導(dǎo)致miRNA被酶降解，但是大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在血液中仍然可以定量檢測到miRNA，說明血液中miRNA其實(shí)具有RNA酶的活性；②PCR擴(kuò)增以后，miRNA的含量沒有受到其他基因組的影響；③在使用RT-qPCR的方法檢測血液中的miRNA時(shí)，就算人為將檢測條件惡化，如將血液放置到強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境中，miRNA仍然能夠被檢測到[11]。所以miRNA在血液中存在十分穩(wěn)定，具有作為特異性標(biāo)志物的潛質(zhì)。

雖然血液中穩(wěn)定存在miRNA已經(jīng)得到證實(shí)，但其來源還未可知。實(shí)驗(yàn)表明，外周血中miRNA分子大多數(shù)都與血液中的蛋白質(zhì)結(jié)合存在，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后的miRNA穩(wěn)定性很高，可以在一定程度上耐受核酸酶的催化和分解[12]。這些都是本次實(shí)驗(yàn)可以在血液中檢測到特異性的miRNA分子的基礎(chǔ)。

目前，檢測miRNA的技術(shù)已經(jīng)有了長期的發(fā)展，可行性也得到較大提高?，F(xiàn)在檢測新的miRNA分子的首選方法就是進(jìn)行基因芯片的克隆測序，因?yàn)榛蛐酒哂懈咝院涂焖傩詢纱筇攸c(diǎn)，還可以同時(shí)進(jìn)行多種miRNA的檢測[13-15]，在目前應(yīng)用較為廣泛，但是這項(xiàng)技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，如靈敏度和特異度都不高，所以廣泛應(yīng)用于miRNA的初步篩選。這樣篩選出來的特異性miRNA還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和定量，即進(jìn)行Northern blot或者RT-qPCR。檢測血液中miRNA最常用的方法就是使用RT-qPCR，這種方法需要選擇合適的內(nèi)參組作為對照，對內(nèi)參的依賴性很大，但是可以提高結(jié)果的可靠性[15]。

本研究結(jié)果顯示，對照組、低級(jí)別組和高級(jí)別組血清miRNA-21（F=5.497，P=0.006）、miRNA-221（F=7.615，P=0.001）和miRNA-222（F=6.304，P=0.003）含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清miRNA-21和miRNA-221含量在對照組最低，在高級(jí)別組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血清高級(jí)別組高于對照組（P＜0.05），而低級(jí)別組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量在膠質(zhì)瘤患者中均較高。血清miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222含量的測定為人膠質(zhì)瘤的診斷提供了新的可靠依據(jù)。但還需要在惡性腫瘤的不同時(shí)期檢測患者血清miRNA的表達(dá)量，提高膠質(zhì)瘤診斷的準(zhǔn)確性和特異性，使其成為早期膠質(zhì)瘤診斷的好方法。

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（本文編輯：雷琪）

R741；R742

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.02.028

第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院a神經(jīng)外科；b耳鼻喉頭頸外科；c藥劑科西安 710032

2016-03-16

王彥剛hanfxqa@163.com