代學(xué)良，孫秀海，李立新，王芳，王法釗，李濤

·論著·

Ngn2促進(jìn)皮膚干細(xì)胞神經(jīng)分化的電生理學(xué)及其機(jī)制研究

代學(xué)良1，孫秀海1，李立新2，王芳1，王法釗1，李濤1

目的：探討Ngn2基因轉(zhuǎn)染皮膚干細(xì)胞（SKPs）促進(jìn)神經(jīng)分化的電生理學(xué)機(jī)制及可能的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠SKPs并純化、鑒定。構(gòu)建包裝含Ngn2基因并用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的病毒載體。將SKPs分3組：Ngn2組為包裝有Ngn2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps，空病毒組為未包裝任何基因的慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps，空白對(duì)照組為未經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps，各組6皿。誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組SKPs的電生理活動(dòng)；Wetern Blot檢測(cè)各組SKps鈉離子通道相關(guān)蛋白Nav1.3及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白Hes1和Dll1表達(dá)水平。結(jié)果：誘導(dǎo)14 d后，Ngn2組SKPs出現(xiàn)電壓依賴性鈉離子通道電流，而其他2組SKPs均未引出鈉離子通道電流；Ngn2組SKPs的Nav1.3蛋白表達(dá)水平高于其他2組（P＜0.01）；Ngn2組SKPs Dll1蛋白的表達(dá)水平高于其他2組，Hes1蛋白的表達(dá)水平低于其他2組（P＜0.01）。結(jié)論：Ngn2基因促使SKPs表達(dá)電壓門控性鈉離子通道，其機(jī)制可能與Notch信號(hào)通路有關(guān)。

皮膚干細(xì)胞；Ngn2基因；神經(jīng)分化；電生理；鈉離子通道；Notch信號(hào)通路

腦脊髓創(chuàng)傷、腦血管意外、帕金森氏病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死。然而，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺乏自我修復(fù)的微環(huán)境，致使神經(jīng)功能永久性喪失。皮膚干細(xì)胞（skin-derived precursors，SKPs）是從動(dòng)物皮膚真皮層提取出一種nestin抗體陽(yáng)性并且具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，在普通誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后可轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞[1]，已成為活體干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)損傷的一個(gè)重要研究對(duì)象[2]。但由于誘導(dǎo)后神經(jīng)轉(zhuǎn)化效率較低，尚未達(dá)到用于細(xì)胞移植的條件[3]。尋找一種方法提高其神經(jīng)分化效率成為熱點(diǎn)。

研究證實(shí)，Neurogenin2（Ngn2）基因在干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中作用明顯。Benedikt Berninger[4]等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)，將Ngn2基因?qū)氤审w鼠大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，證實(shí)Ngn2確實(shí)可開啟神經(jīng)蛋白的表達(dá)。Hatakeyama等[5]將Ngn2、聯(lián)合Nkx6.1、HB9共3個(gè)基因轉(zhuǎn)染大鼠脊髓前體神經(jīng)細(xì)胞，亦使其成為有軸突并向外投射的膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。本研究小組在早期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，將Ngn2基因轉(zhuǎn)染SKPs，誘導(dǎo)7 d后SKPs呈神經(jīng)元樣生長(zhǎng)，神經(jīng)元特異性標(biāo)志物Map-2和NeuN的表達(dá)比例明顯升高，但是目前尚無對(duì)其電生理學(xué)方面的研究。

目前，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)電流測(cè)量靈敏度已經(jīng)達(dá)1 pA，空間分辨率達(dá)到1 μm，被公認(rèn)為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究以慢病毒為載體將Ngn2基因轉(zhuǎn)染入SKPs，誘導(dǎo)分化14 d后用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)其電生理活動(dòng)，并用Wetern Blot技術(shù)檢測(cè)鈉離子相關(guān)蛋白Nav1.3及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白Hes1和Dll1表達(dá)水平，初步探索了Notch信號(hào)通路介導(dǎo)這一過程的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生3～7 d的SD雄性大鼠，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗nestin一抗、山羊抗Hes1一抗和兔抗Dll1一抗購(gòu)于Santa cruz公司；山羊抗Nav1.3一抗購(gòu)于Neuro Mab公司；CY3標(biāo)記的熒光二抗購(gòu)于武漢博士得生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SKPs獲取、鑒定 采用Toma法培養(yǎng)、提純SKPs，免疫熒光技術(shù)鑒定第3代SKPs表面抗原nestin為陽(yáng)性：取出貼壁細(xì)胞培養(yǎng)皿，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS再次洗滌3次，羊血清封閉15 min，兔抗nestin抗體4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，CY3-羊抗兔IgG37℃孵育15 min；PBS洗滌3次，Hochest33258孵育5 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 分組及慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)將培養(yǎng)的第3代SKPs隨機(jī)分為3組，分別為Ngn2組、空病毒組和空白對(duì)照組，每組6皿。Ngn2組為包裝有Ngn2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps，空病毒組為未包裝任何基因的慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps，空白對(duì)照組為未經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的SKps。Ngn2質(zhì)粒構(gòu)建及慢病毒的包裝由上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司完成；以MOI=20計(jì)算SKPs所需要的病毒量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)培養(yǎng)基（內(nèi)含DMED/F12，1%B27，10%FBS，不含生長(zhǎng)因子）于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，細(xì)胞每3天更換誘導(dǎo)液。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)細(xì)胞膜電流在倒置顯微鏡下選擇各組胞膜光滑完整、胞體折光性好、清潔度好的SKPs。拉制玻璃微電極，電極端0.5～2 μm，阻抗為2.8～4 MΩ。在微操縱儀的推動(dòng)下，將玻璃微電極尖端接觸SKPs細(xì)胞膜，并應(yīng)用負(fù)壓抽吸使電極尖端和細(xì)胞膜形成高阻封接。待高阻封接形成穩(wěn)定后，應(yīng)用負(fù)壓抽吸，完成“破膜”。從微電極處引出的全細(xì)胞電流通過膜片鉗放大器（Axon Instruments，USA）輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用pClam pex 8.1專用軟件進(jìn)行采樣分析。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)Nav1.3、Hes1和Dll1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d后，洗滌、裂解、離心SKPs，取上清液。樣本加于15%分離膠/4%濃縮膠上，室溫下100 v電泳2 h，30 mA恒流下轉(zhuǎn)膜。5%牛奶封閉2 h后分別與一抗（抗Nav1.3、抗Hes1和抗Dll1）4℃下孵育過夜，再將其與二抗室溫下反應(yīng)120 min，最后將膜曝光顯色，“Quantity Once”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用STAT 10.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKPs的培養(yǎng)鑒定

培養(yǎng)7 d后見SKPs成簇漂浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均為圓形，見圖1A；在多聚賴氨酸和層粘連蛋白雙重包被的培養(yǎng)皿中SKPs貼壁生長(zhǎng)，見圖1B；免疫熒光結(jié)果顯示幾乎所有第3代SKPs有nestin陽(yáng)性表達(dá)，見圖1C。

2.2 Ngn2基因轉(zhuǎn)染結(jié)果

慢病毒轉(zhuǎn)染SKPs后，細(xì)胞增殖速度無改變，未見死亡細(xì)胞；轉(zhuǎn)染7 d后熒光顯微鏡下見漂浮細(xì)胞團(tuán)的綠色熒光達(dá)到高峰；熒光分布較均勻，分布于整個(gè)細(xì)胞團(tuán)，見圖1D?？詹《窘M和空白對(duì)照組均未見綠色熒光。

2.3 全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)結(jié)果

誘導(dǎo)14 d后，各組取10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。Ngn2組Ngn2-SKPs全細(xì)胞記錄模式下，鉀電流被Cs+和TEA+阻斷，鈣電流被胞內(nèi)EGTA、F-和相對(duì)高濃度（2 mmol/ L）的Mg2+阻斷，置鉗制電位為－80 mV，給予從－80 mV～+60 mV的去極化刺激方波，步幅為+10 mV遞增，波寬為50 ms，均記錄到電壓依賴性鈉離子通道電流，見圖2A；加入特異性阻斷劑TTX 500 nmol/L，2 min后均可完全阻斷該電流，由此證實(shí)所記錄到的電流為鈉電流，見圖2B。而空白對(duì)照組和空病毒組SKPs在全細(xì)胞記錄模式下，鉀電流被Cs+和TEA+阻斷，鈣電流被胞內(nèi)EGTA、F-和相對(duì)高濃度（2 mmol/L）的Mg2+阻斷，選擇直徑＞35 μm細(xì)胞，置鉗制電位為－80 mV，給予從－80 mV～+20 mV的去極化刺激方波，步幅為+10 mV遞增，波寬為30 ms，記錄15次，均未引出電壓依賴性鈉離子通道電流，見圖2C。

2.4 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

誘導(dǎo)14 d后，Ngn2組SKPs Nav1.3蛋白表達(dá)水平均高于其他2組（P＜0.01），空白對(duì)照組和空病毒組SKPs Nav1.3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3A-B。Ngn2組SKPs的Dll1蛋白表達(dá)水平高于其他2組，Hes1蛋白表達(dá)水平低于其他2組（均P＜0.01），空白對(duì)照組和空病毒組SKPs Dll1和Hes1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4A-C。

圖1 SKPs的培養(yǎng)、鑒定及Ngn2基因轉(zhuǎn)染結(jié)果

圖2 各組膜片鉗檢測(cè)結(jié)果

圖3 各組Nav1.3蛋白的表達(dá)水平比較

圖4 各組Dll1、Hes1蛋白的表達(dá)水平比較

3 討論

SKPs首次由加拿大學(xué)者Jean G.Toma從動(dòng)物真皮層提取出來，并被證實(shí)在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和成髓鞘血旺細(xì)胞[6]。有研究證實(shí)，在成人皮膚、毛囊、瘢痕組織及女性乳房皮膚中也可以提取出SKPs[7,8]。本實(shí)驗(yàn)提取乳大鼠背部皮膚真皮層細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后見SKPs成簇漂浮生長(zhǎng)，易被吹散分離為單個(gè)細(xì)胞，能夠持續(xù)傳代至8代以上。培養(yǎng)至第3代，幾乎所有SKPs上神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin表達(dá)呈陽(yáng)性。SKPs作為一種易分離純化的成體干細(xì)胞，且不涉及倫理問題，近年來被視為自體移植治療中樞神經(jīng)損傷的新型種子細(xì)胞。但是，由于未被證實(shí)存在神經(jīng)元電生理活動(dòng)，無法滿足移植需要。

Ngn2基因作為（bHLH）家族的激活型基因,在背側(cè)端腦區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生的原始進(jìn)化中發(fā)揮了重要的作用。Ngn2基因通過激活一系列原神經(jīng)bHLH家族下游轉(zhuǎn)錄因子，諸如Nex1、NeuroM及NeuroD/BETA2來決定神經(jīng)祖細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)，同時(shí)抑制其向膠質(zhì)細(xì)胞的分化[9]。Carol Fode[10]等證實(shí)3個(gè)胚層的分化過程中均有相同的BHLH家族中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而這些因子的表達(dá)順序是Ngn2＞math3＞NeuroD＞Nscl1，Ngn2基因的突變可阻止神經(jīng)嵴向3個(gè)胚層的分化。

神經(jīng)細(xì)胞以動(dòng)作電位的形式傳遞興奮，成熟的神經(jīng)元均有產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力。神經(jīng)干細(xì)胞在分化前尚未表達(dá)功能性鈉通道，分化后鈉通道在成熟神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢怀龢O過程中起到主要作用，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之前即可檢測(cè)出鈉離子電流[11]。Hogg等[12]研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠海馬的神經(jīng)干細(xì)胞在未分化時(shí)無興奮性，無鈉離子電流，而經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可檢測(cè)出TTX敏感的鈉電流。Cho等[13]在神經(jīng)干細(xì)胞膜上未檢出鈉離子電流，轉(zhuǎn)染了NeuroD基因后也檢出TTX敏感的鈉離子電流。因此，細(xì)胞膜上鈉離子電流可作為神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)入分化進(jìn)程的重要鑒定指標(biāo)[14]。鈉離子通道有10個(gè)亞型廣泛存在于齲齒類動(dòng)物中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中，其中Nav1.3主要在發(fā)育早期大腦神經(jīng)元中表達(dá)。在大鼠外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，Nav1.3的表達(dá)均上調(diào)，主要與其在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下痛覺神經(jīng)元興奮性升高有關(guān)[15]。

本實(shí)驗(yàn)Ngn2組用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)到SKPs出現(xiàn)可被TTX阻斷的電壓依賴性性鈉離子通道電流，而空病毒組和空白對(duì)照組未轉(zhuǎn)染Ngn2的SKPs均未檢測(cè)到電壓依賴性鈉離子通道電流；Western Blot也證實(shí)Ngn2組SKPs鈉離子通道相關(guān)蛋白Nav1.3表達(dá)水平高于其他2組（P＜0.01）。提示Ngn2可促使SKPs表達(dá)電壓依賴性鈉離子通道而促進(jìn)神經(jīng)分化。

目前，Ngn2基因促進(jìn)SKPs定向神經(jīng)分化的機(jī)制尚未明確。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中原神經(jīng)基因的產(chǎn)物Mash1和Ngn2可以誘導(dǎo)Notch配體Dll1的表達(dá)，從而激活相鄰細(xì)胞的Notch通路。Notch蛋白是一種跨膜蛋白，被激活后釋放其胞內(nèi)區(qū)域（NICD）至核內(nèi)，和DNA結(jié)合蛋白R(shí)BPj形成NICD-RBPj復(fù)合物，促進(jìn)BHLH因子Hes1和Hes5的表達(dá)。Hes1和Hes5的表達(dá)上調(diào)反過來抑制原神經(jīng)基因的表達(dá)，從而使干細(xì)胞處于相互抑制的狀態(tài)而不分化。這一細(xì)胞間調(diào)節(jié)機(jī)制被稱為“反饋抑制”[16]。研究證實(shí)，成體神經(jīng)干細(xì)胞中抑制Notch信號(hào)通路可誘導(dǎo)神經(jīng)分化，Hes1的表達(dá)降低，Ngn2和Dll1表達(dá)增加。相反，Notch通路的活化可以抑制神經(jīng)分化[17]。

本實(shí)驗(yàn)中，Ngn2組SKPs Dll1的表達(dá)水平高于其他2組，Hes1蛋白表達(dá)水平低于其他2組（均P＜0.01）。推測(cè)SKPs中Ngn2基因過表達(dá)可使Dll1表達(dá)水平上調(diào)，反饋性的使Hes1的表達(dá)水平下調(diào)，這一過程可能是通過抑制Notch信號(hào)通路，打破了干細(xì)胞原有的反饋抑制狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)分化，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探索。

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（本文編輯：唐穎馨）

Electrophysiology of Neurogenin2 Promoting Neural Differentiation of Skin-derived Precursors and Its Mechanisms

DAIXue-liang1,SUNXiu-hai1,LILi-xin2,WANGFang1,WANGFa-zhao1,LI

Tao1.1.ZouchengPeople’sHospital,Shandong273500,China.2.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNJMU,Nanjing210029,China

Objective:To explore the electrophysiology of neurogenin2(Ngn2)promoting neural differentiation of skin-derived precursors(SKPs)and its mechanisms.Methods:SKPs were isolated from SD rat skin tissue and purified and identified.Lentvirus contained Ngn2 gene were enclosed and used as the vehicle for gene transduction.SKPs were divided into three groups(n=6 respectively):SKps in Ngn2 group were transfected with Ngn2 gene via GFP-lentivirus;SKps in blank virus group were transfected with only GFP-lentivirus;SKps in control group were cultured without transfection with lentivirus.After 14-days incubation in neuronal induction medium,electrophysiological analyses were performed.The expression level of Nav1.3,related to Na+channel and the expression levels of Hes1 and Dll1,ligands and effectors of Notch signaling pathway,were detected by Western Blot analysis.Results:The patch-clamp recordings of SKPs in the Ngn2 group A indicated that Ngn2-SKps expressed voltage-gated Na+channel,which could be blocked by 0.5 μm TTX.However,SKPs in the other two groups did not show any inward currents.Western Blot analysis demonstrated that the expression levels of Nav1.3 and Dll1 in the Ngn2 group were higher than those in the other two groups(P＜0.01).However, the expression level of Hes1 in the Ngn2 group was significantly lower than those in the other two groups(P＜0.01).Conclusion:Ngn2 promotes SKPs to acquire voltage-gated Na+channel,usually expressed in neurons, which may be mediated by Notch signaling pathway

skin-derived precursors;neurogenin2;neural differentiation;electrophysiology;Na+channel; Notch signaling pathway

R741；R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.02.001

1.鄒城市人民醫(yī)院山東 273500

2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院南京 210029

濟(jì)寧市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015-57-140）

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81171147）

2016-11-13

代學(xué)良daixueliangns@ sohu.com