許麗 杜晶 萬(wàn)財(cái)鳳 張雨 張曉芬 李鳳華

·實(shí)驗(yàn)研究·

光熱型納米金-共聚物超聲造影劑的制備及其在體外和大鼠乳腺癌模型顯像的實(shí)驗(yàn)研究

許麗 杜晶 萬(wàn)財(cái)鳳 張雨 張曉芬 李鳳華

目的的制備外包納米金殼內(nèi)載全氟丙烷（C3F8）的聚乳酸羥基乙酸（PLGA）光熱型超聲造影劑，觀察其在體內(nèi)外的超聲顯像效果及體外的光熱效能。方法通過(guò)改進(jìn)的乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA納米粒子，包載C3F8氣體后，再用種子生長(zhǎng)法在PLGA表面形成納米金殼，制備C3F8＠PLGA＠Au納米粒子；檢測(cè)其一般特性，采用近紅外激光評(píng)估其體外光熱效能；超聲成像儀觀察體外及大鼠乳腺癌模型成像效果。結(jié)果成功制備C3F8＠PLGA＠Au納米粒子，該粒子的平均直徑為（268．2±80．5）nm，多分散指數(shù)為0.196，Zeta電位為（-22.5±5.2）mV，無(wú)明顯細(xì)胞毒性；在808 nm激光輻照下，粒子有很好的溶液光熱效果；體外及大鼠乳腺癌模型超聲成像實(shí)驗(yàn)中均有增強(qiáng)顯像。結(jié)論成功制備了光熱型納米超聲造影劑，其有良好的體外光熱性能和體內(nèi)外超聲顯像效果，可為乳腺癌診治提供新思路。

超聲檢查；造影劑，納米；光熱治療；納米金；聚乳酸羥基乙酸；大鼠

分子影像學(xué)是借助分子探針，應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像技術(shù)觀察活體組織在分子或細(xì)胞水平的特異性顯像的一門(mén)學(xué)科。超聲分子影像是分子影像學(xué)的重要組成部分，良好的超聲分子探針是實(shí)現(xiàn)超聲分子顯像的關(guān)鍵。隨著超聲成像技術(shù)和生物納米技術(shù)的發(fā)展，多種納米超聲造影劑應(yīng)運(yùn)而生，使血管外顯像成為可能。同時(shí)，借助近紅外激光和光熱劑的光熱療法是近期發(fā)展起來(lái)治療腫瘤的方法，因其操作簡(jiǎn)便，具有非侵入性及治療選擇性等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注［1］。如何將超聲分子影像技術(shù)和光熱治療結(jié)合來(lái)構(gòu)建乳腺癌早期的診療一體化平臺(tái)，值得深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用FDA批準(zhǔn)的聚乳酸羥基乙酸（PLGA）高分子聚合物為核，以有良好光熱性能及生物相容性的納米金為殼，樟腦為致孔劑，內(nèi)填充全氟丙烷（C3F8）氣體，制備集超聲成像和光熱治療于一體的光熱型納米級(jí)超聲造影劑，并評(píng)估其體外光熱性能及體內(nèi)外的超聲顯影能力。

材料與方法

一、主要試劑及設(shè)備

聚烯丙胺鹽酸鹽（PAH）及PLGA（50∶50，美國(guó)Sigma公司），氯金酸三水化合物（美國(guó)Acros公司），全氟丙烷氣體（C3F8，天津晶明公司），聚乙烯醇（PVA，阿拉丁試劑）；百勝M(fèi)yLab Twice彩色多普勒超聲診斷儀，LA 522探頭，頻率為3～9 MHz，機(jī)械指數(shù)0．1；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92－Ⅱ型，寧波新芝公司）；透射電子顯微鏡（JEOL LEM 2010）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本Hitachi S 4800）；馬爾文納米粒度電位分析儀（英國(guó)Malvern Zetasizer Nano ZS90）；紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman Coulter DU 730）。

二、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

人乳腺癌MCF－7細(xì)胞，由上海中科院提供；雌性SD大鼠10只，28日齡，體質(zhì)量100～220 g，由上海斯萊克公司提供。

三、C3F8＠PLGA＠Au納米超聲造影劑的制備及其性質(zhì)檢測(cè)

1．制備：參照文獻(xiàn)［2－3］，稱取PLGA 100 mg和樟腦10 mg分散在二氯甲烷3．5 ml中充分溶解，隨后逐滴加入至預(yù)冷的2%PVA水溶液20.0 ml中，冰水浴條件下應(yīng)用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)乳化2 min，將乳化液在通風(fēng)櫥中揮發(fā)5 h后離心洗滌，真空干燥后充入C3F8氣體；取適量PLGA粉末溶于PAH溶液，磁力攪拌后離心洗滌，沉淀中加入經(jīng)硼氫化鈉還原法制備的檸檬酸鹽穩(wěn)定的納米金溶液，分散攪拌30 min，離心洗滌后重新分散于氯金酸溶液2.0 ml中，磁力攪拌30 min后滴加新鮮制備的鹽酸羥胺溶液（0．5 mol/L）0．3 ml，繼續(xù)攪拌30 min后離心洗滌，即得C3F8＠PLGA＠Au納米粒子。

2．性質(zhì)檢測(cè)：①一般性質(zhì)檢測(cè)：利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡及透射電鏡觀察C3F8＠PLGA＠Au納米粒子的大小、分散性、形態(tài)及結(jié)構(gòu)；使用馬爾文納米粒度電位分析儀測(cè)量納米粒子的平均粒徑、Zeta電位及多分散指數(shù)；通過(guò)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)觀察合成各階段材料的紫外－可見(jiàn)－近紅外吸收光譜；②體外光熱實(shí)驗(yàn)：將C3F8＠PLGA＠Au納米粒子配制成不同濃度（50、100、150、200 μg/ml）溶液，取1 ml溶液移入石英皿中，采用波長(zhǎng)808 nm、功率強(qiáng)度1．0 W的激光照射15 min，以相同體積的去離子水作為對(duì)照，通過(guò)紅外熱像儀記錄溶液溫度。

四、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞，消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞制成懸液；取96孔板，周邊孔培養(yǎng)液隔離，在中間每孔加入100 μl細(xì)胞懸液孵育24 h；加入終濃度為0～200 μg/ml的C3F8＠PLGA＠Au納米材料，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣，分別孵育12、24 h；孵育結(jié)束后，每孔加入100 μl 0．5 mg/ml的3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽繼續(xù)孵育4 h后輕輕吸出，每孔加入150 μl二甲亞砜，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔492 nm處的吸光值。

五、體內(nèi)外超聲顯像實(shí)驗(yàn)

1．體外超聲顯像：將C3F8＠PLGA＠Au納米粒子分散于去離子水中（1 mg/ml），注滿2 ml透明塑料樣品管，封口；另取脫氣水注滿同樣樣品管作為空白對(duì)照組，以脫氣水為透聲窗進(jìn)行實(shí)時(shí)灰階成像和超聲造影成像。

2．乳腺癌大鼠體內(nèi)超聲顯像：取甲基亞硝脲誘導(dǎo)的乳腺癌動(dòng)物模型大鼠6只，隨機(jī)分為納米材料組和生理鹽水組，麻醉并固定動(dòng)物，先以二維超聲檢查腫瘤，選擇最大切面后轉(zhuǎn)入超聲造影模式，單幀留取造影劑注入前圖像，然后兩組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注入200 μl 5 mg/ml的C3F8＠PLGA＠Au納米材料和等體積的生理鹽水，從注入造影劑起全程記錄動(dòng)態(tài)影像，直至造影劑廓清為止。

所有聲學(xué)造影圖像自動(dòng)保存，以備分析。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、C3F8＠PLGA＠Au納米粒子一般性質(zhì)檢測(cè)

成功制備C3F8＠PLGA＠Au納米粒子，如場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（圖1A）和透射電鏡（圖1B）所示，粒子成球形，納米金呈顆粒狀均勻包被于PLGA表面，形態(tài)較規(guī)則，分散性較好；納米粒度電位分析儀測(cè)得粒子的平均粒徑為（268．2±80．5）nm，多分散指數(shù)為0．196，Zeta電位為（－22．5±5．2）mV，其材料粒徑符合納米級(jí)要求，粒徑分布均勻，溶液穩(wěn)定性尚好。

與單純的PLGA納米粒子和納米金顆粒比較，納米金包裹PLGA形成的納米金/共聚物材料，在近紅外區(qū)出現(xiàn)明顯的吸收峰。見(jiàn)圖2。

圖1 電鏡下觀察C3F8＠PLGA＠Au納米粒子

圖2 PLGA納米粒子、納米金顆粒及C3F8＠PLGA＠Au納米粒子的吸收光譜圖

二、C3F8＠PLGA＠Au納米粒子體外光熱實(shí)驗(yàn)

在808 nm激光輻照15 min后，濃度為50、100、150及200 μg/ml的不同C3F8＠PLGA＠Au納米粒子溶液均迅速升溫，200 μg/ml者溫度較去離子水溫度升高11℃。見(jiàn)圖3。

三、C3F8＠PLGA＠Au納米粒子細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

人乳腺癌MCF－7細(xì)胞經(jīng)不同濃度C3F8＠PLGA＠Au納米粒子孵育后存活率均在85%以上，且不同濃度C3F8＠PLGA＠Au納米粒子孵育人乳腺癌MCF-7細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖3 近紅外激光輻照下，不同濃度C3F8＠PLGA＠Au納米粒子的升溫曲線圖

圖4 不同濃度C3F8＠PLGA＠Au納米粒子的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

四、體外超聲顯像實(shí)驗(yàn)

C3F8＠PLGA＠Au納米粒子在二維和超聲造影模式下均有顯像，表現(xiàn)為點(diǎn)狀高回聲，細(xì)密均勻（圖5A、B）；空白對(duì)照組兩種模式均表現(xiàn)為無(wú)回聲（圖5C、D）。

五、乳腺癌大鼠體內(nèi)超聲顯像

C3F8＠PLGA＠Au納米粒子經(jīng)靜脈注入大鼠體內(nèi)后7s時(shí)腫瘤區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)點(diǎn)狀增強(qiáng)（紅色圓區(qū)），約19s達(dá)到峰值，峰值強(qiáng)度約為（8．6±1．7）dB，較注入前明顯增強(qiáng)（圖6A、B）；生理鹽水組注射后無(wú)明顯增強(qiáng)（圖6C、D）。

圖5 C3F8＠PLGA＠Au納米粒子溶液與空白對(duì)照組體外超聲顯像圖

圖6 兩組乳腺癌大鼠體內(nèi)超聲顯像圖

討論

乳腺癌的病死率與癌癥的分期息息相關(guān)，早期診斷及有效的治療極為重要。診療一體化是將診斷和治療整合為一體的策略，功能化的納米材料由于其特定的化學(xué)和物理特性，能融診斷與治療為一體，且可以實(shí)現(xiàn)分子顯像，為乳腺癌的早期診療一體化帶來(lái)了新的希望［4］。高分子聚合物PLGA具有良好的親水特性，表面可修飾，有很好生物相容性和可降解性，容躍和冉海濤［5］研究表明PLGA作為超聲造影劑具有廣闊的應(yīng)用前景；納米金材料因其良好的生物相容性及在近紅外光區(qū)（具有最小的人體組織吸收率，穿透力強(qiáng)）可調(diào)的表面等離子體共振性質(zhì)，不僅可用于生物成像，還可通過(guò)光熱效應(yīng)在激光照射時(shí)成為局域化熱源，用于光熱治療［6］。本實(shí)驗(yàn)制備的C3F8＠PLGA＠Au納米粒子，直徑為（268．2±80．5）nm，達(dá)納米級(jí)別，理論上可穿過(guò)腫瘤病變狀態(tài)下的血管內(nèi)皮間隙，突破臨床上微米級(jí)超聲造影劑的局限，實(shí)現(xiàn)血管外腫瘤細(xì)胞的顯像。材料整個(gè)制備過(guò)程簡(jiǎn)便，PLGA納米粒子作為C3F8＠PLGA＠Au納米粒子的核，是以樟腦作為致孔劑，采用單乳化溶劑揮發(fā)法制備所得，粒徑均一，帶有負(fù)電荷，易于表面修飾；采用靜電吸附法及種子生長(zhǎng)法形成的納米金殼，納米金顆粒均勻吸附于PLGA表面，厚度均勻（圖1）。與文獻(xiàn)［7］中直接將納米金顆粒作為初始材料進(jìn)行單/雙乳化方法所得的Au－PLGA雜化物比較，本方法PLGA表面金顆粒的負(fù)載量更多，保證了材料在近紅外區(qū)的有效吸收，與單純的PLGA相比，可以很好地將光能轉(zhuǎn)化為熱能，有望應(yīng)用于近紅外光熱治療。

超聲造影劑穩(wěn)定性好、抗壓性強(qiáng)及成像維持時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)是其有望應(yīng)用于臨床的必備要素。本實(shí)驗(yàn)制備的納米材料在超聲造影模式下表現(xiàn)為細(xì)密均勻的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲，成像持續(xù)8 min時(shí)仍有較明顯的點(diǎn)狀回聲。材料經(jīng)尾靜脈注入乳腺癌大鼠體內(nèi)后，納米粒子順利地進(jìn)入動(dòng)物血液循環(huán)并在腫瘤區(qū)出現(xiàn)增強(qiáng)顯像，19 s時(shí)達(dá)到峰值，符合腫瘤增強(qiáng)灌注顯像特點(diǎn)，結(jié)合納米粒子良好的光熱性能，有望將超聲顯像和光熱治療集于一個(gè)平臺(tái)，改善乳腺癌診斷和治療脫節(jié)問(wèn)題。此外，納米金和PLGA形成的納米金－共聚物殼核結(jié)構(gòu)，具有空腔和納米金可修飾化表面，也有研究［8］表明Au－PLGA殼核材料可作為藥物、基因等的載體用于腫瘤的光化學(xué)治療，因此本實(shí)驗(yàn)制備的C3F8＠PLGA＠Au納米粒子為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)納米靶向載藥造影劑打下良好的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)制備過(guò)程中充填C3F8氣體可增強(qiáng)納米粒子的回聲散射，但是后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟中可能存在損失，對(duì)終材料氣體的實(shí)際填充量未進(jìn)行定量評(píng)估，納米金－共聚物材料的體外光熱性能良好，但體內(nèi)的光熱效果尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用乳化溶劑揮發(fā)法、種子生長(zhǎng)法及靜電吸附法成功制備了光熱型納米金－共聚物超聲造影劑C3F8＠PLGA＠Au，其體外光熱性能及體內(nèi)外顯像能力均良好，有望作為一種納米診療劑為乳腺癌的診治提供新思路。

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A photothermal ultrasound contrast agent：preparation，in vitro and in vivo investigationofgoldnanoshelledpoly（lactide-co-glycolicacid）nanoparticles

XU Li，DU Jing，WAN Caifeng，ZHANG Yu，ZHANG Xiaofen，LI Fenghua
Department of Medical Ultrasound，Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200127，China

ObjectiveTo prepare a photothermal ultrasound contrast agent with C3F8filled－gold nanoshelled poly（lactide－co－glycolic acid）nanoparticles（C3F8＠PLGA＠Au NPs）and to investigate its photothermal effect and contrast enhanced ultrasound imaging capability．MethodsThe nanoscale agent was fabricated with modified emulsion－solvent evaporation method through filling C3F8into PLGA，followed by the formation of gold nanoshell on the surface．The physicochemical properties of C3F8＠PLGA＠Au NPs were characterized by electronic microscopy and dynamic laser scattering．And its photothermal effect was assessed via monitoring temperature increase under the laser irradiation in vitro．The ultrasonic diagnostic instrument was used to evaluate the ultrasound contrast behavior of C3F8＠PLGA＠Au NPs．ResultsThe C3F8＠PLGA＠Au NPs were observed with spherical morphology，good dispersion（0.196），and uniform size with average diameter of（268．2±80．5）nm and electric potential of（－22．5±5．2）mV．The MTT assay indicated the good biocompatibility of our NPs．The NPs showed good photothermal effect under laser irradiation（808 nm）．And the imaging results in vitro and in vivo demonstrated that C3F8＠PLGA＠Au NPs provided excellent contrast enhancement for ultrasound imaging．ConclusionThe photothermal ultrasound contrast agent has been designed and fabricated．The preliminary studies demonstrate that C3F8＠PLGA＠Au NPs have excellent photothermal effect in vitro and ultrasound imaging capability in vitro and in vivo，which provides new thought for diagnosis and treatment of breast cancer．

Ultrasonography；Contrast agent，nanoscale；Photothermal therapy；Au nanoparticles；Poly（lactic－coglycolic acid）；Rats

R445.1

A

2016-11-29）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81571678）；上海市科委項(xiàng)目（15ZR1425600、14411968200）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院橫向課題（RJKY14－07）

200127 上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（許麗、杜晶、萬(wàn)財(cái)鳳、張雨、李鳳華）；上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（張曉芬）

李鳳華，Email：proflifh＠sina．com