郝曉偉 盧宏濤 夏德萌 楊 蕊 董 昕 諶 衛(wèi) 徐茂錦

(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433)

基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的野生型C57BL/6衰老小鼠血清代謝物輪廓分析

郝曉偉 盧宏濤1夏德萌 楊 蕊 董 昕2諶 衛(wèi)3徐茂錦3

(第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433)

目的 運(yùn)用代謝組學(xué)方法測(cè)定年輕小鼠與衰老小鼠血清源性物質(zhì)譜的變化。方法 收集4周齡(青年組)和40周齡(衰老組)野生型雄性C57BL/6小鼠外周血清，利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC/Q-TOF)技術(shù)對(duì)上述兩組老鼠的血清進(jìn)行代謝輪廓分析，利用正交偏最小二乘法進(jìn)行多變量分析，找出4周齡(青年組)與40周齡(衰老組)小鼠中含量差異顯著的內(nèi)源性物質(zhì)。結(jié)果 衰老組，6種不飽和脂肪酸含量低于青年組，而飽和脂肪酸，主要為硬脂酸和軟脂酸，均高于青年組；十二種溶血磷脂膽堿也明顯降低，長(zhǎng)鏈肉堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、視黃醛、?；撬岷团；悄懰峋陀谇嗄杲M，而谷氨酸、色氨酸等氨基酸也出現(xiàn)不同幅度下降。結(jié)論 代謝組學(xué)可以找出衰老過程中的一些潛在標(biāo)志物，從而推測(cè)衰老在代謝水平上的變化機(jī)制。這主要體現(xiàn)在脂肪酸代謝和蛋白質(zhì)代謝中。

代謝組學(xué)；液質(zhì)聯(lián)用；衰老；血清

年齡老化相關(guān)的疾病如肺癌、代謝綜合征、冠心病以及一些老化退行性疾病等〔1～3〕明顯增多。衰老不是簡(jiǎn)單的年齡增長(zhǎng)，而是身體器官和功能的衰退老化。隨著人口老齡化以及衰老低齡化的加劇，探明衰老的機(jī)制，延緩衰老進(jìn)程，減少由衰老引起的疾病變得日趨重要。機(jī)體是一個(gè)有序的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，體內(nèi)的物質(zhì)在一定的時(shí)期內(nèi)保持一個(gè)動(dòng)態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定。而代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)所有內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性、定量分析，并尋找代謝物與病理生理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分〔4〕。因此運(yùn)用這一新興的生物學(xué)研究手段或許有助于揭示衰老的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠，雄性，4周齡小鼠8只，40周齡小鼠8只，從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購(gòu)置〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002〕，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)SPF級(jí)生物房〔動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SYXK(滬)2012-0003〕。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1290 Infinity)；串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent6538Accurate-Mass Q-TOFMS)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher PRESCO 17)。色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇，甲酸購(gòu)于Fluka公司(Buchs,Switzerland)，超純水由本實(shí)驗(yàn)室Milli-Q 超純水系統(tǒng)(Millipore,Bedford,MA,USA)制得。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集 采集衰老組和青年組小鼠的血液樣本，眶靜脈取血后，先4 000 r/min離心5 min，然后分裝放置于-80℃封存。

1.3.2 代謝組輪廓分析 血液樣品前處理儀器分析前，將血清樣品常溫解凍。取100 μl血液加入300 μl甲醇，渦旋1 min，4℃靜置10 min，然后4℃ 13 000 r/min離心5 min,取上清進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析將經(jīng)過前處理的血樣進(jìn)行UHPLC-Q/TOF MS代謝輪廓分析，采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在序列中隨機(jī)的插入質(zhì)控樣品檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)分析將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent Masshunter Qualitative Analysis軟件，將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成通用的mzdata格式，并經(jīng)過去同位素峰處理。在R軟件平臺(tái)下使用xcms程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析。將得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(版本11.0)分別進(jìn)行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交最小二乘法分析(OPLS-DA)。并且按照PLS-DA或者OPLS的VIP值以及倍數(shù)變化系數(shù)(Fold change>2.0)挖掘差異代謝物質(zhì)。依據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供的元素匹配功能以及Metlin,HMDB,MassBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行初步歸屬。進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行高分辨MS2分析，得到差異代謝物的質(zhì)譜碎片信息，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，對(duì)差異代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 代謝物組學(xué)輪廓分析 青年組與衰老組的血液總離子流如圖1所示。為了篩選與衰老密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，我們采用PLS-DA的方法，正離子模式下PLS-DA的得分圖，散布圖如圖2、圖3所示，衰老組和青年組差異明顯。在散布圖中離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)，表明對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)越大。

A:正離子模式青年組;B:負(fù)離子模式衰老組;C:負(fù)離子模式青年組；D：正離子模式老年組圖1 衰老與青年組小鼠的總離子流圖

A：正離子模式；B負(fù)離子模式圖2 PLS-DA分析衰老與青年組血清代謝物輪廓分析的散布圖

A：正離子模式；B：負(fù)離子模式圖3 PLS-DA分析衰老與青年組血清代謝物輪廓分析的得分

2.2 鑒別與篩選 見表1。VIP值反映了變量在差異中的重要性，常用來篩選差異代謝物。本研究中設(shè)定差異代謝物的閾值為1。衰老組與青年組有顯著差異的變量為差異代謝物，通過對(duì)代謝物的篩選，得到了56種內(nèi)源性的差異代謝物，主要包括不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、磷脂酰膽堿、氨基酸與肉堿等。

表1 野生型C57BL/6小鼠血清差異代謝物

2.3 鑒定代謝物的響應(yīng)值 衰老組6種不飽和脂肪酸含量低于青年組，而飽和脂肪酸(硬脂酸與軟脂酸)均高于青年組；衰老組與青年組相比，十二種溶血磷脂膽堿明顯降低，長(zhǎng)鏈肉堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、視黃醛、?；撬岷团；悄懰峋霈F(xiàn)下降，而谷氨酸、色氨酸等氨基酸也有不同幅度降低。見表1。

3 討 論

衰老是多種因素共同作用的結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠的飼養(yǎng)條件完全相同，因此，我們用一定范圍的年齡增長(zhǎng)來代表衰老的過程。在之前已有大量研究證實(shí)酯類的代謝在衰老的過程起到關(guān)鍵作用〔5,6〕，與此的一致的是，我們也發(fā)現(xiàn)兩組小鼠血清中多種脂肪酸有顯著變化，其中不飽和脂肪酸的含量都呈下降趨勢(shì)，共6種，油酸、亞油酸、二十碳五烯酸、2-辛烯酸、環(huán)氧-9Z-十八碳烯酸、棕櫚油酸；而兩種飽和脂肪酸均上升，分別為硬脂酸和軟脂酸〔7,8〕。不飽和脂肪酸在體內(nèi)起到一個(gè)結(jié)合氧自由基、抗氧化的作用，而它們的氧化產(chǎn)物就是飽和脂肪酸。這與衰老的自由基學(xué)說和線粒體DNA損傷學(xué)說相契合。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體吸入的氧氣80%進(jìn)入線粒體，隨著氧自由基不斷積累，攻擊線粒體內(nèi)長(zhǎng)脂類、DNA和蛋白質(zhì)，線粒體結(jié)構(gòu)與功能受損〔9〕。而線粒體的功能主要是在雙層膜上完成，生物膜主要由磷脂組成，且存在許多各種功能的蛋白質(zhì)。當(dāng)自由基攻擊磷脂和蛋白質(zhì)時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，功能缺失。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)許多溶血性磷脂含量在兩組中的差異較大，而且青年組的含量明顯高于衰老組。例如，溶血磷脂酰膽堿C 20:3、C 14:0、C 18:0、sn-甘油-3-磷酸膽堿〔10〕。他們的含量隨年齡增加而減少也可能與細(xì)胞的凋亡機(jī)制有關(guān)〔11〕,或者是提示機(jī)體在能量代謝障礙和氧化損傷〔12〕

很多關(guān)于磷脂的文獻(xiàn)報(bào)道，中長(zhǎng)鏈肉堿在人的肝臟的衰老中有明顯的指導(dǎo)意義，它在脂肪的氧化中作為載體，負(fù)責(zé)把脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，起到關(guān)鍵的限制酶作用〔3〕。因?yàn)榫€粒體受到損傷，所以肉堿的含量也下降，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。提示肉堿在衰老中可能是一種潛在標(biāo)志物。因?yàn)榫€粒體損傷而受到影響的還有檸檬酸，異檸檬酸的下降，這兩個(gè)三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)可能也說明了能量代謝伴隨衰老的減弱〔13～15〕。由于三羧酸循環(huán)在物質(zhì)能量代謝中起到一個(gè)中心的作用，所以氨基酸的代謝也受到影響，L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、精氨酸、L-色氨酸，它們的含量也隨年齡增長(zhǎng)〔7〕。其中天冬氨酸和谷氨酸在尿素循環(huán)、葡萄糖在肌肉中的利用以及聯(lián)合脫氨中發(fā)揮重要作用〔16〕,而谷氨酸也是合成神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酰胺的重要前體，這與腦疾病的發(fā)作可能有關(guān)〔17〕。而色氨酸參與絲、蘇氨酸合成，在底物磷酸化以及酶聯(lián)反應(yīng)中不可缺少。鞘氨醇-1-磷酸在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)中都發(fā)揮重要功能〔18〕，我們發(fā)現(xiàn)它在衰老組中的含量低于青年組，這可能與許多老年神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病有關(guān)〔14〕。值得注意的是，視黃醛在兩組中的顯著差異可能揭示了老年人視力下降的原因。而?；撬岷团；悄懰岬臏p少則可能說明肝臟在衰老過程中合成膽汁的功能衰退〔13，19〕。同時(shí)黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤合成中的重要物質(zhì)，它們都是下降的，這可能與細(xì)胞分裂的能力減弱有關(guān)〔20〕。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠外周血清開展了對(duì)動(dòng)物衰老在代謝水平初步研究，揭示了脂類代謝和能量代謝參與了衰老過程，這其中自由基學(xué)說可能是引起衰老的主要機(jī)制，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和探討衰老過程。

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〔2015-03-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

諶 衛(wèi)(1985-)，男，主治醫(yī)師，講師，博士，主要從事腎臟病臨床與基礎(chǔ)研究。

郝曉偉(1993-)，男，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)員，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R4；R3

A

1005-9202(2017)06-1346-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.018

1 第二軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系 2 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心 3 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院內(nèi)科教研室