安 君 王 寧 安 康 高 健 劉旭光

(西北民族大學(xué)附屬第一醫(yī)院 寧夏人民醫(yī)院心胸外科，寧夏 銀川 750021)

骨橋蛋白對(duì)壓力過負(fù)荷心衰小鼠的影響

安 君 王 寧 安 康1高 健 劉旭光2

(西北民族大學(xué)附屬第一醫(yī)院 寧夏人民醫(yī)院心胸外科，寧夏 銀川 750021)

目的 同步觀察心肌骨橋蛋白(OTN)、血清氨基末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)在過負(fù)荷心衰(HF)、過負(fù)荷心衰重置于正常負(fù)荷小鼠心臟的影響。方法 選用雄性昆明種系小鼠C57BL/6 野生型小鼠，分為Sham組、過負(fù)荷HF組、過負(fù)荷心衰重新置于正常負(fù)荷(HF-NL)組，觀察三組形態(tài)學(xué)改變、血清NT-proBNP濃度以及OPN mRNA表達(dá)。結(jié)果 光鏡下Sham組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊；過負(fù)荷HF組小鼠心肌纖維間隙增寬，心肌細(xì)胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細(xì)胞呈局灶性壞死；HF-NL組與過負(fù)荷HF組比較，心肌纖維間隙增寬得到改善，心肌細(xì)胞變性、肥大以及局灶性壞死變輕；血清NT-proBNP濃度在Sham組、過負(fù)荷HF組、HF-NL組分別為(54.10±8.91)mg/L、(459.78±22.79)mg/L(與Sham組比較，P<0.01)、(362.67±43.73)mg/L(與過負(fù)荷HF組比較，P<0.01)。OPN mRNA表達(dá)在正常小鼠中的表達(dá)較弱〔(0.95±0.10)%〕；在過負(fù)荷HF組增強(qiáng)〔(3.38±0.12)%，與Sham組比較，P<0.01〕，而在HF-NL組表達(dá)減輕〔(1.97±0.14)%，與過負(fù)荷HF組比較，P<0.01〕。結(jié)論 OPN參與過負(fù)荷心衰置于正常負(fù)荷后的心肌重塑過程，抑制OPN表達(dá)可能是減輕、減緩過負(fù)荷HF發(fā)生、發(fā)展的干預(yù)靶點(diǎn)之一。

小鼠；過負(fù)荷；心衰；骨架蛋白

高血壓等壓力過負(fù)荷所致心衰(HF)機(jī)制仍不甚清楚，心肌纖維化(MF)是過負(fù)荷所致心衰等諸多心血管疾病共同的病理改變〔1〕。MF是指心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中膠原纖維過量積聚,膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變。 ECM作為心肌細(xì)胞骨架能感應(yīng)和傳遞各種刺激信號(hào)參與心肌損傷修復(fù)和重構(gòu)，而ECM非結(jié)構(gòu)蛋白一員的骨橋蛋白(OPN)是公認(rèn)的促纖維化因子〔2〕，通過感應(yīng)和傳遞各種刺激信號(hào)參與心肌損傷修復(fù)、重構(gòu)以及MF。OPN在過負(fù)荷HF中的作用不甚清楚。本研究利用小鼠心衰模型，觀察OPN在過負(fù)荷心衰以及過負(fù)荷心衰重新置于正常負(fù)荷(Unloading)狀態(tài)下的mRNA表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用雄性昆明種系小鼠，20～25 g，鼠齡4周齡，共27只，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。假手術(shù)(Sham)組10只；過負(fù)荷HF組7只，按文獻(xiàn)方法〔3〕，經(jīng)胸骨上窩利用鉭夾部分夾閉10 w主動(dòng)脈弓制備；過負(fù)荷HF10重新置于正常負(fù)荷3 w(HF-NL)組7只。

1.2 外科手術(shù) 按文獻(xiàn)方法〔3〕，制備過負(fù)荷HF以及過負(fù)荷HF重新置于正常負(fù)荷(NL)模型。過負(fù)荷HF：小鼠戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)胸骨上窩顯露主動(dòng)脈弓，用鉭夾部分夾閉右無名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈間的主動(dòng)脈弓，縫合皮膚，完成手術(shù)。過負(fù)荷心衰重新置于正常負(fù)荷(HF-NL)模型：過負(fù)荷HF 10 w后，經(jīng)胸骨上窩顯露主動(dòng)脈弓，取出夾閉的鉭夾，縫合皮膚，完成手術(shù)。10 w后在相同麻醉下首先通過心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察左室舒張末期直徑以及射血分?jǐn)?shù)(EF)判斷過負(fù)荷心衰模型是否合格，不合格小鼠棄之不用。Sham組：手術(shù)操作與過負(fù)荷HF模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉主動(dòng)脈弓。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 各組心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察完畢將小鼠用過量戊巴比妥鈉處死后用甲醛灌注固定，取左室前壁，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 取材同時(shí)取三組(各6只)小鼠血液,離心、取上清，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒操作說明檢測(cè)血清NT-proBNT水平〔4〕。

1.5 OPN mRNA表達(dá) 小鼠心肌組織總RNA 提?。喊碩rizol 法提取說明書提取〔4〕。RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：按RNase H-reverse transcriptase 試劑盒(Invitrogen,USA)說明書步驟進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)：按 SYBR Green Master Mix(Takara,Japan) 說明書試劑盒步驟進(jìn)行。應(yīng)用 ABI Prism 7900 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)分析，用α-Tubulin為基準(zhǔn)校正，進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素ANOVA分析，兩組間用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下Sham組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊；過負(fù)荷HF組小鼠心肌纖維間隙增寬，心肌細(xì)胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細(xì)胞呈局灶性壞死；HF-NL組與過負(fù)荷HF組比較，心肌纖維間隙變窄，心肌細(xì)胞變性、肥大以及壞死變輕。見圖1。

Sham組

過負(fù)荷HF組

HF-NL組

2.2 血清NT-proBNP濃度測(cè)定 血清NT-proBNP濃度在Sham組、過負(fù)荷HF組、HF-NL組分別為(54.10 ± 8.91)mg/L、(459.78±22.79)mg/L、(362.67 ± 43.73)mg/L；組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。

2.3 OPN mRNA表達(dá) OPN mRNA表達(dá)在Sham組表達(dá)較低(0.95 ± 0.10)%，在過負(fù)荷HF組的表達(dá)明顯增強(qiáng)〔(3.38 ± 0.12)%〕,與Sham組比較P<0.01〕，而將負(fù)荷心衰心臟重新置于正常負(fù)荷(HF-NL組)，其表達(dá)較過負(fù)荷HF組顯著減輕〔(1.97 ± 0.14)%,與過負(fù)荷HF組比較，P<0.01〕，見圖2。

圖2 各組OPN mRNA表達(dá)

3 討 論

MF 是多種心血管疾病共同的病理改變,與高血壓等壓力負(fù)荷引起的心衰、心律失常和心源性猝死密切相關(guān)〔1〕。人的OPN基因定位于染色體 4q13 上,為單拷貝基因，不同異構(gòu)體的表達(dá)和功能具有細(xì)胞特異性,其具體機(jī)制尚不清楚〔5〕。OPN的表達(dá)在正常心肌很低,但在纖維化心肌中明顯升高，給予血管緊張素Ⅱ后,小鼠心肌骨橋蛋白表達(dá)升高較MF 提早出現(xiàn)〔6〕，OPN的表達(dá)在壓力超負(fù)荷小鼠左室心肌和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞(CFB)中均顯著升高〔7〕，心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均能表達(dá)OPN。

本研究結(jié)果表明，OPN mRNA表達(dá)變化與同步觀察的心肌形態(tài)學(xué)以及血清NT-proBNP濃度改變相一致，證明OPN參與壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心衰過程。 有報(bào)道亞硝基左旋精氨酸甲酯誘導(dǎo)的高血壓模型大鼠心肌骨橋蛋白表達(dá)下降后，其間質(zhì)纖維化、單核細(xì)胞浸潤(rùn)以及心肌細(xì)胞肥大也有所改善〔8〕，也有報(bào)道在OPN基因缺失小鼠中的MF程度也明顯減輕〔9〕，這與本研究的OPN在HF中表達(dá)增強(qiáng)，而將過負(fù)荷HF重新置于正常負(fù)荷時(shí)表達(dá)得到改的結(jié)果相一致。多種生物分子,如白細(xì)胞介素(IL)-1β、干擾素-γ等能促進(jìn)CFB表達(dá)OPN。我們?cè)谝矆?bào)道，IL-17A直接以及通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9調(diào)控參與小鼠過負(fù)荷心衰過程〔4〕。OPN與IL-17A調(diào)控機(jī)制可能加速過負(fù)荷引起的MF以及心衰的發(fā)生、發(fā)展過程，提示OPN與IL-17A在過負(fù)荷心衰的發(fā)生、發(fā)展可能具有某種調(diào)控關(guān)系。本研究提示OPN參與小鼠壓力過負(fù)荷引起的心衰發(fā)生以及過負(fù)荷心衰置于正常負(fù)荷后的心肌重塑過程，抑制OPN表達(dá)可能是減輕、減緩過負(fù)荷心衰發(fā)生、發(fā)展的干預(yù)靶點(diǎn)之一。

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3 安 君,李永財(cái),劉旭光,等.微創(chuàng)小鼠心衰模型的建立〔J〕.中國(guó)胸心血管外科臨床雜志,2016;23(11):1099-102.

4 安 君,李永財(cái),劉旭光,等.白介素-17A對(duì)壓力過負(fù)荷心衰小鼠的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2016;36(3):1046-7.

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〔2016-10-15修回〕

(編輯 郭 菁)

安 君(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事心衰機(jī)制和防治研究。

R541.3

A

1005-9202(2017)06-1339-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.015

1 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院心胸外科

2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科